El vino

CULTIVO IN VITRO Y TRANSFORMACIÓN TRANSITORIA DE
NICOTIANA BENTHAMIANA POR AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS.
David Vizárraga Revuelto 4º Biotecnología

Introducción y realización de la practica
La practica realizada estará dividida en dos partes: La primera de ellas consistirá en realizar cultivo in vitro, para ello primero realizaríamos los cultivos: Para el
crecimiento de brotes elaboramos uncultivo de Murashige y Skoog donde plantaremos microestaquillas de arboles frutales, que contendrán una yema donde dentro de
un tiempo brotaran los brotes, el segundo cultivo, será el Medio de Enraizamiento ( ME ) ,cuando halla pasado un tiempo y hallan salido los brotes, dichos brotes los
pasaremos al medio de enraizamiento para que broten raíces, estos dos medios se utilizarían para lamicropropagación de plantas, ya que lo primero que queremos es
inducir brotes para luego plantarlos en un medio de enraizamiento para que generen raíces y finalmente llevarlos a la ultima fase: aclimatación de la planta al medio
exterior( fase muy delicada ya que la planta se puede estresar con las condiciones ambientales del exterior ). Posteriormente realizaremos dos cultivos : MSV1 y
MSV2, elprimero de ellos será un medio de enraizamiento y el segundo inducirá brotes, donde se cultivará un fragmento de hoja de violeta africana. Por ultimo
elaboramos un cultivo de inducción de callo MSZ1 donde cultivaremos el hipocotilo de zanahoria y un fragmento de violeta africana. Por ultimo llevaremos los cultivos
a una cámara con luz , temperatura y humedad adecuada para que se puedan desarrollar loscultivos. La segunda parte de la practica es la transformación transitoria
por Agrobacterium tumefaciens en una hoja de Nicotiana benthamiana. Para la realización de esta practica, primero inocularemos las distintas estirpes de
A.tumefaciens en LB y mediremos D.O para coger las estirpes que tenga la tasa de crecimiento similar, posteriormente mezclaremos con los dos plásmidos que
deseamosintroducir en A.tumefaciens, el primer plasmado contendrá un promotor constitutivo, un gen de fluorescencia amarilla YPF y el gen de interés en nuestro
caso el Fad8 ( añade tres enlaces a los ácidos grasos en posición 8, obteniendo ácidos grasos OMEGA 3 ) y el segundo plasmado que contendrá un promotor constitutivo
y el gen P19 ( sintetiza una proteína que inhibe el silenciamiento, ya que se uniráal RNA de doble cadena). Finalmente en nuestra solución tendremos estirpes de
A.tumefaciens con el plásmido P19 y otras con el plásmido Fad8. Finalmente para la introducción de la solución con las estirpes de A.tumefaciens utilizaremos una
parte de la hoja de Nicotiana ( a la que posteriormente se la inducido un estrés, para que al introducir la solución no sufra ningún efecto negativo ) y conuna
jeringuilla rasparemos un poco el envés de la hoja para realizar una pequeña herida por donde introduciremos nuestra solución. En unos días veremos la expresión de
la proteína fluorescente en las hojas infectadas a través de una lámpara de ultravioleta, que nos indicara si el gen de interés se ha introducido correctamente en el
genoma de la planta.

Resultados
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CULTIVO IN VITRO:
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Medio MS para la inducción de brotes ( Fase I micropropagación ).
Como se puede apreciar
en las fotos, se ha
conseguido inducir brotes
en las microestaquillas
cultivadas el día 0, esto es
debido a la elevada
concentración de
citoquininas que hay en el
medio , para inducir la
división celular.

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Día 0

Medio Enraizamiento ( Fase IIImicropropagación ).:
Día 31

Medio rico en auxinas para la inducción de raíces,
como se puede observar en nuestro cultivo se ha
formado una pequeña raíz. Se tendría que haber
formado una mayor cantidad de raíces y de mayor
longitud, la explicación a lo sucedido es el
taponamiento de luz que había en la cámara por
la gran cantidad de botes que contenía. Se podría
dejar el cultivo más tiempo en la...