Electroforesis Adn
Páginas: 11 (2554 palabras)
Publicado: 24 de septiembre de 2012
ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO
Departamento de Ciencias de la Vida
Ingeniería en Biotecnología
Integrantes: Cueva Mauricio, Gómez Gabriela, González Estefanía, Ortiz Daniel
Curso: 4 “A”
Fecha: 2012-07-05
Practica de Laboratorio
1. Tema: Electroforesis de ADN_______________________________________
2. Objetivos:
General:
Identificar los productosobtenidos e interpretar las bandas resueltas mediante electroforesis en gel de agarosa.
Específicos:
· Realizar un gel de agarosa y someterlo a una corrida electroforética.
· Explicar la presencia de agentes contaminantes.
· Justificar el uso de ciertos reactivos en la práctica.
3. Introducción
La electroforesis consiste en la separación de moléculas(proteínas, isoenzimas, ácidos nucleícos) a través de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. Para el caso de ácidos nucleícos, al ser estos cargados negativamente por causa de su grupo fosfato, durante la electroforesis van a dirigirse hacia el polopositivo o ánodo (Posso, 2008).
La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se torna líquida (Puerta, 2009). Esto le da la característica de porosidad y actúa como filtro haciendo que los fragmentos de menor tamaño migren más rápidamente hacia el ánodo que aquellos de mayortamaño. Una ventaja que posee la agarosa sobre la acrilamida es que no es un compuesto tóxico y además permite el análisis de ácidos nucleícos con pesos moleculares muy variados. Sin embargo, su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida (UNAM, 2006).
La concentración de agarosa utilizada para electroforesis está entre el 0.5 % y el 2%, además es la que define el tamaño delos poros; a mayor concentración, menor el tamaño de los poros y viceversa. El voltaje igualmente presenta gran influencia, ya que al ser mayor, la velocidad de migración del ADN en la matriz de agarosa aumenta. La concentración a usar se escoge según el tamaño del ácido nucléico a analizar (Posso, 2008). Durante la electroforesis, los ácidos nucleícos con un alto peso molecular migrarán al ánodomás lentamente que ácidos nucleícos con un menor peso molecular. La razón de esto es que los ácidos nucleícos de alto peso tardan más tiempo en atravesar los poros de agarosa (UNAM, 2006).
Previo a electroforesis; una vez pesado el polvo de agarosa y disuelto en buffer y luego colocado en la cuba con el peine que forma los pozos, las muestras de ácidos nucleícos serán homogeneizadas y se lesdará peso con sustancias como el Blue juice (color azul), para luego colocarlas en los pocillos del gel (UNAM, 2006). Los buffer o tampón en los que no se pretende recuperar el DNA usado (geles analíticos) más comúnmente es el TBE, compuesto de Tris base, ácido bórico y EDTA; mientras que para geles preparativos se usa TAE, que presenta menor efecto de tampón y en lugar de ácido bórico presentaácido acético (Posso, 2008).
Preparado el gel de agarosa y posterior a electroforesis, para poder visualizarlo se utilizan colorantes fluorescentes como el bromuro de etidio, el cual es peligroso al ser un agente mutagénico, frente a esto se presentan otras alternativas como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados específicamente para reducir los riesgos potencialesde mutagénesis. Con esto los ácidos nucleicos separados pueden visualizarse mediante tinción, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. La estimación de las concentraciones de ADN puede realizarse sobre una fotografía digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de...
Departamento de Ciencias de la Vida
Ingeniería en Biotecnología
Integrantes: Cueva Mauricio, Gómez Gabriela, González Estefanía, Ortiz Daniel
Curso: 4 “A”
Fecha: 2012-07-05
Practica de Laboratorio
1. Tema: Electroforesis de ADN_______________________________________
2. Objetivos:
General:
Identificar los productosobtenidos e interpretar las bandas resueltas mediante electroforesis en gel de agarosa.
Específicos:
· Realizar un gel de agarosa y someterlo a una corrida electroforética.
· Explicar la presencia de agentes contaminantes.
· Justificar el uso de ciertos reactivos en la práctica.
3. Introducción
La electroforesis consiste en la separación de moléculas(proteínas, isoenzimas, ácidos nucleícos) a través de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. Para el caso de ácidos nucleícos, al ser estos cargados negativamente por causa de su grupo fosfato, durante la electroforesis van a dirigirse hacia el polopositivo o ánodo (Posso, 2008).
La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se torna líquida (Puerta, 2009). Esto le da la característica de porosidad y actúa como filtro haciendo que los fragmentos de menor tamaño migren más rápidamente hacia el ánodo que aquellos de mayortamaño. Una ventaja que posee la agarosa sobre la acrilamida es que no es un compuesto tóxico y además permite el análisis de ácidos nucleícos con pesos moleculares muy variados. Sin embargo, su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida (UNAM, 2006).
La concentración de agarosa utilizada para electroforesis está entre el 0.5 % y el 2%, además es la que define el tamaño delos poros; a mayor concentración, menor el tamaño de los poros y viceversa. El voltaje igualmente presenta gran influencia, ya que al ser mayor, la velocidad de migración del ADN en la matriz de agarosa aumenta. La concentración a usar se escoge según el tamaño del ácido nucléico a analizar (Posso, 2008). Durante la electroforesis, los ácidos nucleícos con un alto peso molecular migrarán al ánodomás lentamente que ácidos nucleícos con un menor peso molecular. La razón de esto es que los ácidos nucleícos de alto peso tardan más tiempo en atravesar los poros de agarosa (UNAM, 2006).
Previo a electroforesis; una vez pesado el polvo de agarosa y disuelto en buffer y luego colocado en la cuba con el peine que forma los pozos, las muestras de ácidos nucleícos serán homogeneizadas y se lesdará peso con sustancias como el Blue juice (color azul), para luego colocarlas en los pocillos del gel (UNAM, 2006). Los buffer o tampón en los que no se pretende recuperar el DNA usado (geles analíticos) más comúnmente es el TBE, compuesto de Tris base, ácido bórico y EDTA; mientras que para geles preparativos se usa TAE, que presenta menor efecto de tampón y en lugar de ácido bórico presentaácido acético (Posso, 2008).
Preparado el gel de agarosa y posterior a electroforesis, para poder visualizarlo se utilizan colorantes fluorescentes como el bromuro de etidio, el cual es peligroso al ser un agente mutagénico, frente a esto se presentan otras alternativas como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados específicamente para reducir los riesgos potencialesde mutagénesis. Con esto los ácidos nucleicos separados pueden visualizarse mediante tinción, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. La estimación de las concentraciones de ADN puede realizarse sobre una fotografía digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de...
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