Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterización electroforética de DNA plasmídico

17.- Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterización electroforética de DNA plasmídico
Carmen Alicia Padilla Peña, Jesús Diez Dapena, Emilia Martínez Galisteo, José Antonio Bárcena Ruiz, Concepción García Alfonso
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba
RESUMEN
Laelectroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha electroforesis se aplicanmarcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio. En esta práctica, se pretende que el alumno comprenda el fundamento teórico de esta técnica y sus aplicaciones, llevando a cabo la separación electroforética en gel de agarosa de DNA plasmídico que el mismo alumno va a aislar y purificar a partir de un cultivo bacteriano. Sehan desarrollado un gran número de métodos para la purificación de DNA plasmídico de bacterias y todos ellos implican invariablemente tres pasos: crecimiento de la estirpe bacteriana portadora, recogida y lisis de las bacterias y purificación del DNA plasmídico. A continución, el DNA aislado se puede analizar mediante electroforesis en gel de agarosa.
Palabras clave: ácidos nucleicos,electroforesis, gel de agarosa, marcadores de peso molecular, plásmidos.
Abreviaturas empleadas. DNA: ácido desoxirribonucleico; LB: Luria-Bertani; SDS: dodecil sulfato sódico; TBE: Tris-borato-EDTA (etilen-diamino tetraacético); UV: luz ultravioleta.
1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
El término electroforesis se usa para describir la migración de una partícula cargada bajo la influencia de un campo eléctrico.Muchas moléculas importantes biológicamente (aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos…) poseen grupos ionizables y existen en solución como especies cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. Estas especies cargadas se van a separar en función de su carga cuando se aplica un voltaje a través de los electrodos. Existen muchos tipos de electroforesis, que se englobanen dos categorías fundamentales:
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-Electroforesis de frente móvil.
-Electroforesis de zona.
Actualmente, sólo se utiliza la electroforesis de zona, en la cual la muestra se desplaza sobre un soporte sólido, como papel de filtro, celulosa o gel (agarosa, acrilamida…) y los componentes de la muestra migran en forma de pequeñas bandas, también llamadas zonas.
La electroforesis en gel es unatécnica muy utilizada para separar moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos. Los materiales más comunes para separar moléculas de ácidos nucleicos son polímeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampón de pH alrededor de 8. De esta forma, las moléculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarán alpolo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño, van a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al logaritmo de su pesomolecular. Es importante la utilización de marcadores de tamaño conocido porque nos permitirán calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema.
En el caso de los geles de agarosa, se le añade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV,...