Electroforesis dna de un plasmido

Electroforesis de dna plasmídico en gel de agarosa.
 

 
 
Objetivos: Preparar, realizar una electroforesis en gel de agarosa e interpretar los resultados.
 
Preparación del gel:

Luego se dejo enfriar para que el gel solidifique.
 
Preparación de las muestras:
Ponemos en un epp limpio 27 ul de la sn de dna plasmídico obtenida en el tp3, y le agregamos 3 ul buffer de siembra.Mezclamos.
El buffer de siembra esta compuesto por:
* Glicerol, que le va a conferir mayor densidad a las muestras, y van a precipitar en el fondo del pocillo y no van a quedar flotando en el buffer.
* Y dos colorantes que los voy a usar para ver a simple vista por donde andan mis muestras mientras las estoy corriendo. El azul de bromofenol (BPB): el una molécula pequeña, que va a ir al frentede la corrida. Y el XCl: migra más lento, me va a marcar la mitad de la corrida.
    Luego colocamos las muestras en los pocillos que se formaron en el gel por acción de los dientes del peine, y corrimos las muestras.
Resultados de la corrida:
Los números indican cada carril.
 

 
El gel que prepararon los profesores tiene 30 calles, en ellas corrimos:
 
SUPERIOR
1. Nada
2.T7T3a 18 sin cortar con nucleasas de restricción -tiene forma CCC-.
3. T7T3a 18 cortado con Hind III -como el plasmido tiene un sitio de corte para esta enzima el plasmido queda de forma lineal-.
4. T7T3a 18 cortado con Ssp I, el plasmido tiene dos sitios de corte para esta enzima, por eso vemos dos bandas que corresponden a dos fragmentos de dna lineal de distinto peso molecular.
5.Marcadores de PM
6. Sf2 cortado con BamH I, como el plasmido tiene un solo sitio de corte para esta enzima vamos a ver una banda que corresponde a dna lineal.
7. Nada
8. Plasmidos del grupo 1, es dna plamídico purificado en el TP N° 3 tratado con Rnasas.
9. Plasmidos del grupo 2, es dna plamídico purificado en el TP N° 3, el chorreado que se observa por debajo de la banda quecorresponde al dna plasmídico corresponde a contaminación de esa muestra por rna.
10. Plasmidos del grupo 3, es dna plamídico purificado en el TP N° 3 tratado con Rnasas.
11. Plasmidos del grupo 4, igual que el carril n° 9.
12. Plasmidos del grupo 5, es dna plamídico purificado en el TP N° 3 tratado con Rnasas.
13. Plasmidos del grupo 6, igual que el carril n° 9
14. Nada15. Marcadores de PM
 
INFERIOR
1. Nada
2. Marcadores de PM
3. Sf2 cortado con BamH I, igual que el carril 6 de la parte superior
4. Nada
5. Plasmidos del grupo 7, es dna plasmídico purificado en el TP N° 3 tratado con Rnasas.
6. Plasmidos del grupo 8, es dna plasmídico purificado en el TP N° 3, el chorreado que se observa por debajo de la banda que corresponde aldna plasmídico corresponde a contaminación de la muestra por rna.
7. Plasmidos del grupo 9, igual que el carril n°5.
8. Plasmidos del grupo 10, igual que el carril n°6.
9. Plasmidos del grupo 11, igual que el carril n°5, pero también se observa claramente una banda por debajo de la de los plasmidos de forma CCC, creemos que corresponde a plasmidos de forma OC debido a la formaciónde un nick en el plasmido, pero no sabemos por que corrió más rápido que el plasmido CCC.
10. Plasmidos del grupo 12, igual que el carril n°6.
11. Plasmidos del grupo 13, igual que el carril n°5.
12. Plasmidos del grupo 14, igual que el carril n°6.
13. Nada
14. Nada
15. Nada
 
Cuestionario:
 
1) Se usa una solución buffer en la electroforesis para que laconductividad eléctrica sea optima, el agua destilada es mala conductora de la energía eléctrica.
2) Usamos buffer a ph neutro para garantizar que se mantengan las cargas negativas de los nucleotidos.
Si usamos buffer a ph3 al haber más H+ sueltos neutralizan las cargas negativas de los fosfatos y los plasmidos correrían de forma diferente.
3. Fue contestada en la parte que se explica como fueron...