Electroforesis En Gel De Agarosa

PRACTICA No. 2

Electroforesis en gel de agarosa y visualización de ADN plasmídico

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

Un método que permite visualizar ADN plasmídico o fragmentos del mismo es la electroforesis en gel de agarosa, en la cual las moléculas de ADN se separan en función de su tamaño. Esta técnica consiste en someter la mezcla de moléculas de ADN embebidas en un gel de agarosa aplicandoun campo eléctrico. Las moléculas de ADN son atraídas al polo positivo debido a la carga neta negativa las cadenas consecuencia de sus grupos fosfato. Las moléculas más pequeñas migran más rápido que las grandes al verse menos “frenadas” por el gel de agarosa en su desplazamiento. Cuando los fragmentos se han separado, el gel se sumerge en una solución que contiene bromuro de etidio y luego seilumina con luz UV. El bromuro de etidio (EtBr) es una molécula plana con afinidad por el ADN que se intercala entre los pares de bases y que tiene la particularidad de fluorescer cuando está unido a él. Al iluminar el gel con luz UV se ven bandas de fluorescencia que corresponden a moléculas de ADN.

MATERIAL

Puntas estériles.
Pipetas automáticas.
Agua destilada.
Tanques, camas y peines deelectroforesis.
Fuente de alimentación.
Agarosa.
Microcentrífugas.
Vaso de precipitado (para desecho).
Erlenmeyer de 100 ml.
Microondas.
Balanza.
Cinta adhesiva.
TAE.

PROCEDIMIENTO

1. Fabricación del gel de agarosa al 1 % y preparación de la muestra
a. En un matraz mezclar una cantidad adecuada de agarosa (1 g) con tampón TAE (100 ml). Calentar la mezcla (agarosa + TAE)con la ayuda de un microondas u hornillo eléctrico hasta fundir y disolver completamente la agarosa (¡cuidado al agitar el matraz, que la agarosa al calentarse puede salpicar abruptamente fuera del matraz y producir serias quemaduras!).
b. En un tubo eppendorf limpio añadir 20 μl (10 μl del ADN aislado anteriormente + 10 μl de agua) de la disolución de ADN y 3 μl de “tampón de carga”.c. Centrifugar ligeramente la mezcla SÓLO si hay demasiadas gotas repartidas dentro del tubo, con objeto de recoger todo el volumen de muestra.
d. Depositar la muestra en uno de los pocillos del gel de agarosa al 1% previamente fabricado (éste se ha colocado con anterioridad sumergido en tampón TAE en una
e. Cerrar o tapar la cubeta de electroforesis, colocar los electrodosde tal forma que el polo negativo quede al lado de los pocillos y el polo positivo en el extremo opuesto del gel, hacia donde va a migrar el ADN, y aplicar una corriente eléctrica continua de 100-120 voltios
f. Detener la electroforesis tras unos 60 minutos o cuando el colorante haya recorrido las tres cuartas partes del gel. Visualizar el ADN con ayuda de un transiluminador de luzultravioleta de onda corta.

2. Tinción Rápida de Geles de Agarosa en 100x Fast Blast DNA Stain

Este protocolo permite una rápida visualización de las bandas de ADN en geles de agarosa en alrededor de 15 minutos. Para una rápida tinción, el tinte Fast Blast DNA (500X) deberá ser diluido a una concentración de 100X. Recomendamos usar 120 ml de Fast Blast a 100X para teñir dos bandejas individualesde gel de agarosa de 7x7 cm ó 7x10 cm que las proveen los kits educativos Bio-Rad. Si se usan otras bandejas, añada volumen suficiente de la solución del tinte hasta sumergir completamente el gel.

Después de la electroforesis, los geles de agarosa deben ser retirados de su bandeja antes de ser colocados en la solución para teñir. Esto se logra al sostener la base de la bandeja del gel con unamano y, gentilmente, empujar el gel hacia fuera con el pulgar de la otra mano. Debido a que el gel es frágil, se le debe de dar atención especial mientras es manipulado. Recomendamos ampliamente el uso de una espátula larga u otra superficie de soporte para transferir el gel de un contenedor a otro. La distinción requiere el uso de mínimio un contenedor largo de volumen de al menos 500 ml, en...