Electroforesis En Geles De Agarosa
Páginas: 9 (2130 palabras)
Publicado: 23 de agosto de 2011
Objetivo
En este trabajo práctico se hizo una corrida electroforética del ADN plasmídico purificado en el trabajo práctico anterior con el objetivo de visualizar el proceso y calcular el peso molecular de otra muestra de ADN lineal incógnita.
Introducción
El método de la electroforesis es empleado para separar por peso molecular diferentes compuestos orgánicos cargados, ya sea proteínas oácidos nucleicos, para visualizarlas o purificarlas. Este método necesita un soporte que deje pasar las moléculas, pero que les oponga diferente resistencia (rozamiento viscoso) de acuerdo con su tamaño y forma. Para ello se utiliza un gel de agarosa o poliacrilamida poroso. Así, las moléculas distintas, al tener distinta resistencia, migran a diferente velocidad y quedan separadas.
Como lamolécula de ADN está cargada negativamente porque contiene grupos fosfatos, será atraída por el ánodo, positivo, en la cuba de electroforesis por medio de una fuerza electrostática. El que se utilice un gel es importante, porque en un medio acuoso habría mayor difusión y muy poco rozamiento viscoso, de modo que se haría imposible lograr una corrida precisa.
Diferentes concentraciones de gelmodifican el tamaño de los poros, lo cual es útil para separar distintas clases de moléculas. Por ejemplo, con un poro chico (mayor concentración de agarosa o poliacrilamida), se pueden resolver, es decir identificar, diferencias de pocas bases entre cada uno.
Es importante notar también que la migración no solo depende del peso molecular, sino también de la forma, ya que en la corridaexperimentarán diferentes rozamientos viscosos. Los diferentes topoisómeros, es decir las diferentes formas de la misma molécula, harán una corrida diferente. La forma superenrollada (CCC), al ser más pequeña y compacta, migrará más que otra que tenga más superficie haciendo resistencia al avance, como una lineal (L) o de cadena abierta (CA).
Procedimiento
Como dijimos, el método usa las fuerzaselectrostáticas de los átomos para arrastrarlos de un margen a otro. Por esta razón hay que preparar un lugar, una cuba, de electroforesis con una fuente eléctrica que transmita corriente. Esta cuba también necesita tener el gel que haga la resistencia al avance.
La preparación de la cuba fue responsabilidad de los docentes a cargo, quienes habían preparado una solución que contenía agarosa 0,8%,bromuro de etidio 10mg./ml. y TAE 1X. Al tener concentración de agarosa relativamente baja, los poros en la red de eran más grandes. Entonces a menor concentración de agarosa los poros van a ser más grandes debido a que va a haber menor cantidad de uniones entre ambas moléculas y de esta forma los fragmentos más grandes correrán más lento mientras que los más chicos lo harán más rápido.
El bromuro deetidio (manipulado por la docente ya que es un compuesto cancerígeno) tiene la función de hacer identificable al ADN. Lo logra uniéndose a las bases de los nucleótidos y de esta forma, como es visible a la luz ultravioleta, permite visualizar el ADN en color naranja cuando está bajo ese tipo de luz.
El TAE es una solución búfer conformada por Tris, acetato y EDTA, que mantiene el pH constante ypermite la conducción de la corriente ya que tiene electrolitos; el agua sola no transmitiría la electricidad.
Nosotros preparamos el plásmido junto con el búfer de siembra. Tomamos 5 μl de la muestra purificada en el TP pasado y agregamos 2 μl de búfer de siembra 5x, esto se hizo con sumo cuidado para que no se dañaran los plásmidos. El búfer tenía dos colorantes (xilene-cianol 0,1% y azul debromofenol 0,1%) y glicerol. La función de los colorantes fue la de servir como marcadores visibles para no excederse en el tiempo de electroforesis, y el glicerol para aumentar la densidad de la solución, y de esta manera evitar que cuando se lo colocara en la cuba de electroforesis, la solución con los plásmidos difundiera.
El gel de agarosa utilizado en el trabajo práctico había sido...
En este trabajo práctico se hizo una corrida electroforética del ADN plasmídico purificado en el trabajo práctico anterior con el objetivo de visualizar el proceso y calcular el peso molecular de otra muestra de ADN lineal incógnita.
Introducción
El método de la electroforesis es empleado para separar por peso molecular diferentes compuestos orgánicos cargados, ya sea proteínas oácidos nucleicos, para visualizarlas o purificarlas. Este método necesita un soporte que deje pasar las moléculas, pero que les oponga diferente resistencia (rozamiento viscoso) de acuerdo con su tamaño y forma. Para ello se utiliza un gel de agarosa o poliacrilamida poroso. Así, las moléculas distintas, al tener distinta resistencia, migran a diferente velocidad y quedan separadas.
Como lamolécula de ADN está cargada negativamente porque contiene grupos fosfatos, será atraída por el ánodo, positivo, en la cuba de electroforesis por medio de una fuerza electrostática. El que se utilice un gel es importante, porque en un medio acuoso habría mayor difusión y muy poco rozamiento viscoso, de modo que se haría imposible lograr una corrida precisa.
Diferentes concentraciones de gelmodifican el tamaño de los poros, lo cual es útil para separar distintas clases de moléculas. Por ejemplo, con un poro chico (mayor concentración de agarosa o poliacrilamida), se pueden resolver, es decir identificar, diferencias de pocas bases entre cada uno.
Es importante notar también que la migración no solo depende del peso molecular, sino también de la forma, ya que en la corridaexperimentarán diferentes rozamientos viscosos. Los diferentes topoisómeros, es decir las diferentes formas de la misma molécula, harán una corrida diferente. La forma superenrollada (CCC), al ser más pequeña y compacta, migrará más que otra que tenga más superficie haciendo resistencia al avance, como una lineal (L) o de cadena abierta (CA).
Procedimiento
Como dijimos, el método usa las fuerzaselectrostáticas de los átomos para arrastrarlos de un margen a otro. Por esta razón hay que preparar un lugar, una cuba, de electroforesis con una fuente eléctrica que transmita corriente. Esta cuba también necesita tener el gel que haga la resistencia al avance.
La preparación de la cuba fue responsabilidad de los docentes a cargo, quienes habían preparado una solución que contenía agarosa 0,8%,bromuro de etidio 10mg./ml. y TAE 1X. Al tener concentración de agarosa relativamente baja, los poros en la red de eran más grandes. Entonces a menor concentración de agarosa los poros van a ser más grandes debido a que va a haber menor cantidad de uniones entre ambas moléculas y de esta forma los fragmentos más grandes correrán más lento mientras que los más chicos lo harán más rápido.
El bromuro deetidio (manipulado por la docente ya que es un compuesto cancerígeno) tiene la función de hacer identificable al ADN. Lo logra uniéndose a las bases de los nucleótidos y de esta forma, como es visible a la luz ultravioleta, permite visualizar el ADN en color naranja cuando está bajo ese tipo de luz.
El TAE es una solución búfer conformada por Tris, acetato y EDTA, que mantiene el pH constante ypermite la conducción de la corriente ya que tiene electrolitos; el agua sola no transmitiría la electricidad.
Nosotros preparamos el plásmido junto con el búfer de siembra. Tomamos 5 μl de la muestra purificada en el TP pasado y agregamos 2 μl de búfer de siembra 5x, esto se hizo con sumo cuidado para que no se dañaran los plásmidos. El búfer tenía dos colorantes (xilene-cianol 0,1% y azul debromofenol 0,1%) y glicerol. La función de los colorantes fue la de servir como marcadores visibles para no excederse en el tiempo de electroforesis, y el glicerol para aumentar la densidad de la solución, y de esta manera evitar que cuando se lo colocara en la cuba de electroforesis, la solución con los plásmidos difundiera.
El gel de agarosa utilizado en el trabajo práctico había sido...
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