Electroforesis En Geles De Poliacrilamida

“ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA”

La electroforesis es una técnica de separación de moléculas cargadas por migración en un campo eléctrico. Las moléculas se separan en función de su carga eléctrica, desplazándose al electrodo de carga contraria y a mayor velocidad cuanto mayor es la carga de la molécula.
Cada molécula se desplaza en el campo eléctrico alcanzando una velocidadconstante. En el estado estacionario, la fuerza impulsora (fuerza del campo eléctrico) se equilibra con la resistencia al avance (fuerza de fricción hidrodinámica) en el medio en que se desplaza.
Se define la movilidad electroforética como la velocidad de desplazamiento por unidad de campo eléctrico. En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de cada molécula definesu comportamiento y separación en el espacio. Diferentes moléculas tendrán diferente movilidad electroforética en un medio determinado.
Hay tres tipos de electroforesis:
De frente móvil.
Zonal.
Continua.
Se pueden utilizar diferentes medios de soporte para evitar perturbaciones mecánicas y los efectos de las corrientes de convección en la separación. Como medios de soporte se puedenutilizar papel, acetato de celulosa, geles de almidón, geles de agarosa o geles de poliacrilamida.
Los geles de poliacrilamida son el resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Controlando la concentración de ambas obtenemos geles de diferente grado de reticulación (diferente diámetro de poro). Uno de los métodos de electroforesis más comúnmente aplicadopara proteínas es el que emplea geles de poliacrilamida (PAGE = polyacrylamide gel electrophoresis) en presencia del detergente aniónico dodecilsulfato sódico (SDS). Esta técnica es conocida como SDS-PAGE. Para ello se prepara un gel en placa vertical.

Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por esotienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración. Empleando geles de sílice o de acetato de celulosa y aplicando las proteínas en una zona estrecha en torno a los electrodos se pueden determinar diferenciasde carga neta (carga total/masa) entre proteínas. Este método se denomina electroforesis zonal. La matriz de poliacrilamida no es un buen soporte para este método pues la migración de las proteínas en su seno no sólo es proporcional a la carga neta sino también al tamaño y forma de las proteínas..
Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son químicamente inertes,transparentes y estables en un amplio rango de pH’s, temperatura y fuerza iónica.
Algunas características destacables de la electroforesis en geles de poliacrilamida son :
·        Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecruzador (“cross-linking”), la bis-acrilamida en presencia de un iniciador y un catalizador. Como iniciador se sueleutilizar TEMED (N,N,N,N'-tetrametilnediamina) y como catalizador el ión persulfato (S2O8-) que se añade en forma de persulfato amónico. En algunas situaciones, como por ejemplo en el isoelectroenfoque en el que la presencia de persulfato puede interferir con la electroforesis se emplean ribofavina y TEMED.
·        Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues el oxígeno es un inhibidor de lapolimerización. Además, durante la polimerización se libera calor que podría provocar la formación de burbujas en el seno del gel.
·        La velocidad de polimerización viene determinada por la concentración de persulfato (catalizador) y TEMED (iniciador).
·        La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida, siendo menor el poro cuanta más...