Electroforesis En Geles De Poliacrilamida
Páginas: 5 (1137 palabras)
Publicado: 28 de octubre de 2012
Informe de Prácticas
Electroforesis en geles de poliacrilamida
Nombre y Apellidos: xxxxxxxxxx
1.Fundamento de la practica:
En esta practica emplearemos un método electroforético desnaturalizante para la determinación de proteínas y sus pesos moleculares.
La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los métodos más utilizados para la purificación, análisis ycaracterización de proteínas. La técnica permite separar moléculas cargadas y explota diferencias en movilidad cuando se les somete a la acción de un campo eléctrico. La electroforesis se lleva a cabo sobre un soporte inerte, generalmente sobre geles de poliacrilamida (PAGE). En la electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE), como su propio nombre indica, se utilizan agentes desnaturalizantes deproteínas, como pueden ser: detergentes (p.e. SDS) y agentes reductores (2- mercaptoetanol, DTT). Para la visualización de las proteínas se utilizan diferentes métodos de tinción, siendo el más habitual el azul de coomassie. En la SDS-PAGE, la separación es función del tamaño (masa molecular), lo que permite determinar el peso molecular de las proteínas. Para ello se compara la movilidad electroforética(Rf) de la proteína de peso molecular desconocido con el de proteínas de referencia de peso molecular conocido.
2.Material, montajes y reactivos necesarios:
• Solución acrilamida/bisacrilamida (30%): se pesan 29,2 g de acrilamida y 0,8 g de
bisacrilamida y se enrasa a 100 ml con agua destilada.
• Amortiguador del gel separador: 18,15 g de Tris y disolver en agua, ajustar el pH a8,8
con HCl y enrasar a 100ml.
• Amortiguador del gel compactador (superior o stacking): pesar 3 g de Tris y disolver en
agua, ajustar a pH 6,8 con HCl y enrasar a 100ml.
• Amortiguador de la cámara (10x): 12 g de Tris, 57,6 g de glicina, 4 g de SDS disolver en
agua y ajustar el pH a 8,4 (pero al preparar o reactivos el pH debe quedar en torno a ese
valor). Aforar a 400 ml. Este tampón esde almacén y debe diluirse 10 veces poco antes de utilizar.
• Amortiguador de las muestras (2X): 10ml del amortiguador del gel superior, 16 ml de
solución de SDS, 50 mg de azul de bromofenol, 12 ml de glicerol y 4 ml de agua.
• Persulfato de amonio 10%: la solución debe mantenerse en desecador y prepararse al
momento. Pesar 0,5 gr y enrasar en 5ml.
• Solución de SDS 10%: 10 gr de SDS ydisolver en 100ml.
• Solución fijadora: 250 ml de metanol, 35 ml de de ácido acético, 215 ml de agua. Guardar en recipiente hermético.
• Colorante azul de Coomassie R-250: 0,25 gr de colorante azul de Coomassie R-250, 225 ml de metanol, 46 ml ácido acético, 230 ml de agua. Se disuelve el colorante en metanol, luego agregar el ácido y por último el agua.
• Decolorante: 200ml de metanol, 100 ml deetanol, 50 ml de ácido acético 650 ml de agua.
3.Procedimiento operativo de la práctica:
1.- Realizamos el montaje necesario sobre el que verteremos el gel de poliacrilamida.
2.- Preparamos el gel de poliacrilamida, que estará formado por dos partes el gel separador y el gel compactador. Para el primero mezclamos 11781 µl de agua desionizada, 8750 µl de amortiguador gel, 350 µl de SDS,14000 µl de acrilamida bis-acrilamida, 21µl TEMED y 105 µl de persulfato amonico. Para el gel compactador empleamos 6000 µl de agua desionizada, 2520 µl de amortiguador gel, 132 µl de SDS, 1320 µl de acrilamida bis-acrilamida, 8 µl de TEMED y 40 µl de persulfato amónico.
3.- Al prepara el gel cuidaremos de que los dos últimos componentes no sean mezclados hasta el momento en que se vierta elgel entre las placas de vidrio para evitar que polimerice antes de lo previsto. Una vez depositado el gel y ya polimerizado con ayuda de una pipeta pasteur introducimos un poco de agua para que corriga esta el menisco del gel y su superficie sea uniforme.
Posteriormente haremos lo mismo con el segundo gel compactador, salvo que antes de que polimerice intruduciremos el “peine” el cual servirá...
Electroforesis en geles de poliacrilamida
Nombre y Apellidos: xxxxxxxxxx
1.Fundamento de la practica:
En esta practica emplearemos un método electroforético desnaturalizante para la determinación de proteínas y sus pesos moleculares.
La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los métodos más utilizados para la purificación, análisis ycaracterización de proteínas. La técnica permite separar moléculas cargadas y explota diferencias en movilidad cuando se les somete a la acción de un campo eléctrico. La electroforesis se lleva a cabo sobre un soporte inerte, generalmente sobre geles de poliacrilamida (PAGE). En la electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE), como su propio nombre indica, se utilizan agentes desnaturalizantes deproteínas, como pueden ser: detergentes (p.e. SDS) y agentes reductores (2- mercaptoetanol, DTT). Para la visualización de las proteínas se utilizan diferentes métodos de tinción, siendo el más habitual el azul de coomassie. En la SDS-PAGE, la separación es función del tamaño (masa molecular), lo que permite determinar el peso molecular de las proteínas. Para ello se compara la movilidad electroforética(Rf) de la proteína de peso molecular desconocido con el de proteínas de referencia de peso molecular conocido.
2.Material, montajes y reactivos necesarios:
• Solución acrilamida/bisacrilamida (30%): se pesan 29,2 g de acrilamida y 0,8 g de
bisacrilamida y se enrasa a 100 ml con agua destilada.
• Amortiguador del gel separador: 18,15 g de Tris y disolver en agua, ajustar el pH a8,8
con HCl y enrasar a 100ml.
• Amortiguador del gel compactador (superior o stacking): pesar 3 g de Tris y disolver en
agua, ajustar a pH 6,8 con HCl y enrasar a 100ml.
• Amortiguador de la cámara (10x): 12 g de Tris, 57,6 g de glicina, 4 g de SDS disolver en
agua y ajustar el pH a 8,4 (pero al preparar o reactivos el pH debe quedar en torno a ese
valor). Aforar a 400 ml. Este tampón esde almacén y debe diluirse 10 veces poco antes de utilizar.
• Amortiguador de las muestras (2X): 10ml del amortiguador del gel superior, 16 ml de
solución de SDS, 50 mg de azul de bromofenol, 12 ml de glicerol y 4 ml de agua.
• Persulfato de amonio 10%: la solución debe mantenerse en desecador y prepararse al
momento. Pesar 0,5 gr y enrasar en 5ml.
• Solución de SDS 10%: 10 gr de SDS ydisolver en 100ml.
• Solución fijadora: 250 ml de metanol, 35 ml de de ácido acético, 215 ml de agua. Guardar en recipiente hermético.
• Colorante azul de Coomassie R-250: 0,25 gr de colorante azul de Coomassie R-250, 225 ml de metanol, 46 ml ácido acético, 230 ml de agua. Se disuelve el colorante en metanol, luego agregar el ácido y por último el agua.
• Decolorante: 200ml de metanol, 100 ml deetanol, 50 ml de ácido acético 650 ml de agua.
3.Procedimiento operativo de la práctica:
1.- Realizamos el montaje necesario sobre el que verteremos el gel de poliacrilamida.
2.- Preparamos el gel de poliacrilamida, que estará formado por dos partes el gel separador y el gel compactador. Para el primero mezclamos 11781 µl de agua desionizada, 8750 µl de amortiguador gel, 350 µl de SDS,14000 µl de acrilamida bis-acrilamida, 21µl TEMED y 105 µl de persulfato amonico. Para el gel compactador empleamos 6000 µl de agua desionizada, 2520 µl de amortiguador gel, 132 µl de SDS, 1320 µl de acrilamida bis-acrilamida, 8 µl de TEMED y 40 µl de persulfato amónico.
3.- Al prepara el gel cuidaremos de que los dos últimos componentes no sean mezclados hasta el momento en que se vierta elgel entre las placas de vidrio para evitar que polimerice antes de lo previsto. Una vez depositado el gel y ya polimerizado con ayuda de una pipeta pasteur introducimos un poco de agua para que corriga esta el menisco del gel y su superficie sea uniforme.
Posteriormente haremos lo mismo con el segundo gel compactador, salvo que antes de que polimerice intruduciremos el “peine” el cual servirá...
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