Electroforesis nativa alfa-amilasa

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UNIVERSIDAD ANDRÉS BELLO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE FISIOLOGÍA CELULAR BIO135
SECCIÓN: 1
PROFESORES: Juan Antonio Valdés
Sylvia Flores

TRABAJO PRÁCTICO N°6:

ACTIVIDAD α-AMILASA EN SEMILLAS DE CEBADA DURANTE LA GERMINACIÓN

Integrantes:Miguel Martínez Covarrubias
Juan Manuel Jerez Baraona
Ignacio Gómez Olivares

Fecha del Práctico:
18 Junio 2010

Fecha de Entrega:29 Junio 2010
Introducción

La α-amilasa es una de las enzimas mas estudiadas debido a su rol en la degradación del almidón, ya que esta permite una germinación de las semillas, el cual es degradado en los enlaces 1-4 del interior (endoamilasa) en diferentes dextrinas que debido a su disminución en tamaño puede serhidrolizada por la β-amilasa, sin embargo la α-amilasa es una enzima que se encuentra regulada tanto por hormonas, o diferentes factores, tales como la temperatura y el pH, además posee un peso molecular de 50 Kda aproximadamente [1][2]. La germinación se lleva con la hidratación y posterior liberación de giberelinas, las cuales inducen la síntesis de las enzimas hidrolíticas, que hidrolizan elalmidón que se encuentra el endosperma, produciendo glucosa que es transportada por difusión, para generar energía [3].

Las hormonas que regulan la actividad de la α-amilasa son etileno, el cual es la única hormona en estado gaseoso, provoca o induce la síntesis y la liberación de la α-amilasa, también se encuentran las citoquininas y las giberelinas las cuales producen el acido giberélico queinducen la germinación, sin embargo el Acido Abscísico (ABA) inhibe la síntesis de la α-amilasa ya que inhibe la síntesis de mRNA y proteínas [4]. La α-amilasa presenta características fundamentales en los cuales , la enzima trabaja a pH 5-7, además de ser resistente a las temperaturas iguales a 70 °C , además la α-amilasa necesita de un cofactor Ca+ , el cual proviene por ejemplo del cloruro decalcio. La β- amilasa por el contrario, necesita un pH 4,5 y una temperatura menor a 70 °C para que se produzca un buen funcionamiento, si la temperatura es mayor o igual a 70 °C la enzima se denatura[1].

En este practico determinaremos la presencia y actividad de la α-amilasa en semillas, esta se determina por medio de una electroforesis nativa que a diferencia de la denaturante, presenta unaseparación debido a su carga y su masa, además la aparición de solo una banda, ya que en la electroforesis denaturante, se puede producir la aparición de una o más bandas [5]. Por otra parte en la electroforesis buscaremos determinar la acción de la enzima α-amilasa, por medio de la utilización de una solución de Lugol.

Parte Experimental

• Extracción de amilasa para su análisis medianteelectroforesis:

Comenzamos helando el mortero y el buffer en hielo (4ºC), luego se procedió a agregar las semillas, con 1 mL del buffer, y se homogeneizó utilizando el mortero, de manera que quede una solución blanca. Luego con una tijera se cortó la punta de una micropipeta, y se recuperó la solución en un tubo Eppendorf. Posteriormente el homogeneizado se centrifugó en una centrífuga refrigeradapor 15 minutos a 10.000 rmp (º4C). Se extrajo el sobrenadante utilizando una micropipeta y se llevo a un nuevo tubo Eppendorf. Luego se llevo a un baño María (70ºC) por 10 minutos.

• Cuantificación de proteínas:

Se llevo a cabo extrayendo 10 (l de la muestra anterior y se llevo a un nuevo tubo Eppendorf, se le agregó 240 (l de agua destilada y 250 (l de la solución A. Esta solución se...