Electroforesis SDS




Índice

1ºParte
Objetivo……………………………………………………………………………pág.2
Fundamento teórico………………………………………………………………..pág.2
Material…………………………………………………………………………….pág.3
Reactivos…………………………………………………………………………..pág.3
Muestra…………………………………………………………………………….pág.3
Procedimiento……………………………………………………….……………..pág.3

2ºParte
Objetivo……………………………………………………………………………..pág.5
Fundamentoteórico…………………………………………………………………pág.5
Material……………………………………………………………………………..pág.5
Reactivos……………………………………………………………………………pág.5
Equipos……………………………………………………………………………..pág.5
Procedimiento………………………………………………………………………pág6
Observación de resultados………………………………………………………….pág.6
Bibliografía…………………………………………………………………………pág.7


































1ºParte: preparación de geles de electroforesis vertical

Objetivo:Preparar el gel para una electroforesis vertical para posteriormente someter las muestras a una separación electroforética.

Fundamento teórico

Uno de los métodos de electroforesis más comúnmente aplicado para proteínas es el que emplea geles de poliacrilamida (PAGE = polyacrylamide gel electrophoresis) en presencia del detergente aniónico dodecilsulfato sódico (SDS). Esta técnica es conocidacomo SDS-PAGE. Para ello se prepara un gel en placa vertical.
En la preparación del gel, la polimerización de los monómeros de acrilamida produce cadenas lineales. Al incluir bisacrilamida, ésta da lugar a puntos de ramificación en el polímero, lo que permite formar una matriz tridimensional, dando lugar al gel de poliacrilamida. El tamaño de los huecos o poros que forma la retículadel polímero depende de la concentración de acrilamida y del grado de entrecruzamiento (es decir, de la proporción de bisacrilamida con respecto al total). Así, variando la concentración de acrilamida y bisacrilamida en la preparación del gel se consiguen distintos grados de porosidad y, por tanto, distintos intervalos de separación de proteínas. También se añade un tampón (comúnmente Tris-HCl).Además, se añade un agente iniciador de la polimerizacón como el persulfato amónico, que al disolverse en agua genera radicales libres que transforman la acrilamida en radical libre y se inicia la polimerización. También se añade al medio TEMED (N,N,N’,N’-tetrametil-etilenodiamina) como catalizador porque puede existir en forma de radical libre.

Agarosa

La agarosa, coloide naturalque se extrae de las algas, es un polisacárido lineal (con un peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repetición de la unidad básica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6-
anhidrogalactosa. La agarosa es muy frágil y las manipulaciones pueden destruirla con facilidad. Los geles de agarosa poseen grandes «poros» y se emplean fundamentalmente para separarlas moléculas grandes con un peso molecular de más de 200 kDa.
Los geles de agarosa permiten una electroforesis rápida, pero con una resolución limitada por cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse. Ello obedece al tamaño de los poros y no puede controlarse.

Tampón de electroforesis

La movilidad electroforética del ADN se ve afectada porla composición y la fuerza iónica del tampón de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampón de elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se desnaturaliza.
Se dispone de varios tiposde tampones para la electroforesis de ADN nativo bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentración de aproximadamente 50 mM (pH 7,5 – 7,8). Los tampones de electroforesis suelen prepararse en forma de soluciones concentradas y se conservan a temperatura ambiente. El TBE se utilizaba...