Electroforesis

PRACTICA 7



OBJETIVO:
Comprobar de la migración electroforética de los aminoácidos sometidos a un campo eléctrico en función de su carga y punto isoeléctrico.

INTRODUCCIÓN:
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej.,electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa.
La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte ungel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleídos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstasse moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.
La gran mayoría de macromoléculas están cargadas eléctricamente y, al igual que los electrolitos, se pueden clasificar en fuertes y débilesdependiendo de la constante de ionización de grupos ácidos y básicos. Por ejemplo los ácidos nucleicos son poliácidos fuertes.
Por lo general, para caracterizar la molécula se determina la velocidad a la que esta se mueve en un campo eléctrico y se utiliza para determinar, en el caso de proteínas, la masa molecular o para detectar cambios de aminoácidos y separar cuantitativamente distintas especiesmoleculares; en el caso de ácidos nucleicos se determina su tamaño, medido en pares de bases.
MATERIALES Y REACTIVOS:
• Cromatograma
• Cámara
• Vasos de precipitados 50 ml
• Pipetas
• Guantes
• Soluciones de aminoácidos: leucina, lisina y ácido aspártico
• Solvente (hidróxido y acetato de amonio, pH de 8.1 )
• Muestras de jugos de algún cítrico.

METODOLOGIA:

El dispositivo experimentalnecesario para realizar una electroforesis zonal en papel consiste en:

• Una fuente de alimentación que suministre un potencial constante (300 V).
• Una cubeta de electroforesis en papel de celulosa. La cubeta posee dos compartimentos separados, cada uno de los cuales contiene un electrodo de platino, que deben conectarse a la fuente de alimentación mediante los cables con conectoresadecuados, uno para el electrodo que hace de cátodo y otro para el que hace de ánodo.

Las principales precauciones que hay que tener son:

• El papel de celulosa hay que procurar no tocarlo con los dedos. El papel hay que manejarlo con las pinzas de madera.
• No contaminar las soluciones de los aminoácidos patrón y de la muestra problema.
• Desde el momento en que se conecte la fuente de corriente ala cubeta de electroforesis, hasta que termine la misma, no se deben de tocar los cables, conexiones o disolución que esté en contacto con la corriente.

a.- Aplicación de las muestras.
• Se traza con el lápiz una línea muy débil en el centro del papel. En la línea se señalan débilmente cinco puntos distribuidos equitativamente a lo ancho de la placa.
• Al mismo tiempo se señala en el margensuperior derecho de la tira de papel el signo (+), para indicar el extremo del papel que se va a situar en el compartimento de la cubeta que va a actuar como ánodo.


b.- Electroforesis de las muestras.
Una vez aplicadas las muestras, se rocía ligeramente el papel con la solución tampón de electroforesis mediante el pulverizador, procurando no mojar directamente las muestras.

Se quita la...