electroforesis

Introducción
La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica, cuya magnitud depende del pH del medio en el que se encuentran. Como consecuencia, se desplazan cuando se ven sometidas a un campo eléctrico.
Se denomina electroforesis a la técnica por la cual se separan biomoléculas en disolución al ser sometidas a un campo eléctrico. Se trata de una técnica fundamentalmente analítica,aunque también se puede realizar con fines preparativos.
Cada molécula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rápidamente una velocidad constante al equilibrase la fuerza impulsora (fuerza del campo eléctrico) con la resistencia al avance fuerza de fricción o rozamiento) impuesta por el medio en el que se desplaza.
En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidadde carga molecular define su separación en el espacio; al ir transcurriendo el tiempo, se van separando progresivamente.
Al ser el medio de soporte a su vez un polielectrolito, esta constituido por iones, que son atraídos y así recubren los iones de la muestra, lo que altera su comportamiento en el campo. Todo ello hace que el tratamiento teórico cuantitativo de la electroforesis sea muy difícily que esta técnica sea de poca utilidad para obtener información precisa sobre la estructura de las moléculas. Sin embargo, es enormemente útil como técnica analítica y preparativa.
La electroforesis de proteínas en geles con una matriz de poliacrilamida, comúnmente denominada electroforesis en poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide gel electrophoresis') es sin duda alguna una de las técnicas másampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de proteínas. La electroforesis en poliacrilamida es un método conveniente, rápido y económico a nivel de muestra pues se requieren sólo cantidades del orden de microgramos de proteína.
Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen lapropiedad de desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración. La electroforesis en geles de poliacrilamida posee múltiples aplicaciones donde unas de las más relevantes son: purificación, análisis y caracterización de proteínas,determinación de masa relativa de proteínas, verificar la concentración de proteínas, detección de modificaciones en las proteínas y mapeo de péptidos (digestión de péptidos). Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son químicamente inertes, transparentes y estables en un rango amplio de pHs, temperatura y fuerza iónica.
Los objetivos esperados al término de la actividad prácticason:
Introducción en la técnica SDS-PAGE en cámara mini-gel vertical.
Elaboración y polimerización de “geles de separación” de poliacrilamida.
Elaboración de “stacking gel”.
Comprender principios físicos y químicos en una corrida electroforética y sus usos en la práctica clínica.
Realizar y comprender los procesamientos del gel, luego de la separación electroforética (fijación, tinción,decoloración, etc.)
Analizar las bandas proteicas obtenidas tras la separación electroforética, tanto de muestras conocidas como muestras problemas.

METODOS

1) Ensamblado de la cámara electroforética: para ello, utilizando la unidad ensambladora, se montaron y alinearon 2 placas de vidrio, previamente limpiadas con alcohol y se comprobó que estuvieran firmes. Luego usando la peineta, se delimitóel gel.

2) Preparación del gel de separación.

Esquema de trabajo



Luego de mezclar los componentes en el mismo órden que aparecen en la tabla (10%), se introducen cuidadosamente y con la ayuda de una micropipeta la mezcla entre los 2 vidrios previamente ensamblado, cuidando de no perder muestra por la parte inferior, adema de evitar la formación de burbujas hasta un nivel que permita...