electroforesis

PROTOCOLO DE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

Objetivo
Separación de los fragmentos de distinto tamaño de ADN en un gel de agarosa, en el que dichos fragmentos migraran a diferentevelocidad según su peso molecular al ser sometidos a una corriente eléctrica.

Material
Agarosa (Multipurpose de Roche)
Tampón Tris-Acetato(TAE) solución de trabajo:
Tris-Acetato 0.04MEDTA 0.001M
Solución stock concentrada (por litro) 50x:
Tris base 242g
Ácido acético glacial 57.1ml
EDTA (pH 8.0) 0.5M 100ml
Tampón de carga 6x:
Azul de bromofenol 0.25%
Xylenecyanol 0.25%
Glicerol 30% en H2O
Bromuro de etidio (10 mg/ml)
Conservar a 4ºC

Método
La concentración del gel de agarosa depende del tamaño de los fragmentos de ADN a separar, siendola concentración mínima el 0.7% (fragmentos grandes de varias Kpb) y la máxima el 4% (fragmentos de 50-150 pb). Se pesa 1gr de agarosa por tanto por ciento y por 100 ml de volumen de gel.Mezclar la muestra con el tampón de carga, el volumen de muestra depende del tamaño de peine con el que se han hecho los pocillos en el gel de agarosa, normalmente es de 10-30 l. Detampón de carga se añade 1/6 del volumen de muestra.
Introducir el gel de agarosa en la cubeta de electroforesis con el tampón TAE y hacer pasar una corriente de 10 V/cm de gel. Se deja eltiempo necesario para que el frente migre hasta el final del gel. Después se tiñe el gel con bromuro de etidio (10 mg/ml) durante 10´, luego pasamos el gel a una cubeta de agua pararetirar el exceso (2´), finalmente observamos las bandas con luz UV y hacemos una fotografía.

PROTOCOLO DE AMPLIFICACIÓN POR PCR DEL GEN HUMANO CCR5

Objetivo
Determinación de lascondiciones óptimas de temperatura y concentración de MgCl2 para la amplificación por PCR del gen CCR5 humano para determinación posterior de polimorfismos genéticos por electroforesis.