Electroforesis

Electroforesis

Técnica que describe la separación en un campo eléctrico de bio-moléculas al migrar a través de un medio de soporte (geles de agarosa o poliacrilamida para ácidos nucleicos), lo cual depende de su carga eléctrica, forma y tamaño.

Geles de poliacrilamida (PA)
Forma geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, que permiten buena visualizaciónde las bandas durante un tiempo prolongado; variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el tamaño del poro, aunque cada vez se emplea menos en diagnóstico por su neurotoxocidad.
Geles de agarosa
La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición homogénea), cuyas disoluciones (~0.5 a 2 %) poseen lapropiedad de permanecer liquidas por encima de 50º C y formar un gel semisólido al enfriarse. Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas.

Fuentes de error en la electroforesis
Es una técnica muy sensible que puede ser afectada por muchos errores experimentales, comola temperatura durante la polimerización y la corrida del gel, la velocidad de la polimerización, niveles de catalizador, pureza del reactivo,  tiempo de corrida y preparación de las muestras.

TINCION DEL ADN DESPUES DE LA ELECTROFORESIS

Bromuro de etidio
La fluorescencia en esta tinción es inducida por la luz ultravioleta que pasa a través del bromuro de etidio, ya que es una moléculaplanar que se intercala entre las bases apiladas de DNA, su posición estable y su proximidad a las bases favorece un incremento en la fluorescencia. Puede utilizarse para detectar cadenas dobles y sencillas de DNA y RNA.

Nitrato de plata
Solo se aplica a geles de poliacrilamida (PA), y se divide en los siguientes pasos: fijación, tinción con plata, enjuague del exceso de plata, reveladoy secado. La solución fijadora ayuda a que el DNA se fije al gel de PA. Al aplicar la plata, la carga positiva de sus iones de plata le permiten unirse al DNA, y su reducción posterior con la solución reveladora cambia su color formando de bandas en el gel. Su principal ventaja es su sensibilidad, hasta 100 veces mayor que el bromuro de etidio.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Las enzimas de restricción,también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester.

Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula.

Nomenclatura
■ se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de labacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima.
■ La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. Ej:
 
Eco RI ( E = género Escherichia
co = especie coli
R = cepa RV 13I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Existen 3 tipos:
Tipo I y Tipo III
■ Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan) por una enzima metiltransferasa que transfiere grupos metilo desde S-adenosilmetionina a bases específicas (A, G C o T)
■ Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. Las Tipo I cortanlejos de la secuencia de reconocimiento, y las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen
■ Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.
Tipo II:
■ Sólo tienen actividad de restricción
■ Cortan de manera consistente y predecible dentro de una secuencia palindrómica (se lee igual...