Electroforesis

PRACTICA NO 7: DETECCIÓN DE PRODUCTOS OBTENIDOS POR PCR
MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA.

1. INTRODUCCIÓN
Para detectar los productos obtenidos después de varios de los procedimientos
realizados en un laboratorio molecular, como son: extracción de ADN, cortes con
enzimas de restricción y amplificación de ADN o ADNc mediante PCR se
requiere la utilización de la electroforesiscomo metodología analítica que permite
visualizar estos productos.
La electroforesis es un procedimiento en el cual una partícula cargada se hace
desplazar a través de un medio aplicando un campo eléctrico. Por lo tanto, esta
permite que macromoléculas como aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos
y ácidos nucleicos, se muevan hacia el polo positivo o negativo, en función de la
carga queposean ((Bula, 1982) y de esta manera se separen por la velocidad de
migración bajo la acción de un campo eléctrico.
2. OBJETIVOS
•
•

Analizar diferentes productos enzimáticos y de PCR obtenidos de la
experimentación en el laboratorio molecular.
Utilizar la electroforesis de agarosa como método de separación y análisis de
ácidos nucleicos

3. MARCO TEORICO
Las moléculas de ADN dedoble cadena lineal migran a través del gel a una
velocidad que es inversamente proporcional al logaritmo del número de pares de
bases que conforman dicha molécula. Esto permite calcular el tamaño en pares de
bases de un ADN con base en la migración electroforética.
Un fragmento de ADN lineal de un tamaño dado y en un tiempo definido migra a
distancias diferentes a través de geles que contienendiferentes concentraciones
de agarosa. De esta manera usando geles de diferentes concentraciones, es
posible separar un amplio rango de moléculas de ADN. (Tabla No.1)

Tabla No. 1. Rango efectivo de separación de ADN en geles de agarosa
Concentración
agarosa en el
(%p/v)
0.3
0.6
0.7
0.9
1.2
1.5
2.0

de Rango efectivo de separación
gel
de moléculas de DNA lineal (Kb)
5 – 60
1 –20
0.8-1.0
0.5 – 7
0.4-6.0
0.2 – 3
0.1 –2

Los ADN circulares súper enrollados (forma I) y circulares con un corte (forma III)
migran a través de geles de agarosa con diferentes movilidades. La forma I del
ADN es una estructura compacta que hace que la superficie de contacto con la
matriz sea menor, lo que hace que la molécula migre una distancia mayor y de
manera más rápida que laforma III, en la que la superficie de contacto es mayor.
Aplicación de Voltajes
La distancia usada para determinar el gradiente de voltaje es la distancia entre los
electrodos, no la longitud del gel.

Diagrama de electroforesis

PRELABORATORIO
1. Explique detalladamente cuales son los buffers utilizados en el corrido
electroforético y sus componentes (TAE, TBE).
2. ¿Cuáles son suspropiedades y cuando se utilizan?
3. ¿Cuáles son los métodos más utilizados para visualizar y cuantificar el ADN en
un corrido electroforético?
4. ¿Qué es el buffer de carga y que propósitos cumple en la electroforesis?
5. ¿Cuáles son los buffer de electroforesis en agarosa más comunes?
4. MATERIALES Y REACTIVOS
Reactivos:
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Agarosa al 2%
Agua desionizada grado I (MQ) estéril(H2O dd)
Tampón de electroforesis (TBE 10x = Tris base 10.8 g, ácido bórico 5.5 g
EDTA 0.5 M pH 8.0 4 ml completar con agua desionizada a 100 ml)
Bromuro de etidio 10mg/ml
Tampón de carga (Buffer de carga 6X basado en glicerol= glicerol 50%, EDTA
1 mM pH 8.0, azul de bromofenol 0.25%, xylene cyanole 0.25%)
Muestras de DNA diluidas en buffer TE (Tris-HCl 10mM EDTA 1 mM)

Nota: Enconcentraciones de agarosa entre el 0.5- y 1.4% , el naranja de acridina
migra a la misma velocidad que el DNA de doble cadena de un tamaño de 50 pb;
el azul de bromofenol (AB) migra a la misma velocidad que el DNA de doble
cadena de un tamaño de 300 pares de bases, mientras que el xylene cyanole (XC)
migra a una rata similar al DNA de 4 kilo bases (Kb)
Materiales
Cámara de electroforesis para geles...