electroforesis


ELECTROFORESIS EN GEL











MARC GARRIDO I SAIOA ALEJO
CURS 2013/14
LA SALLE BONANOVA
BIOLOGIA
OBJECTIU:
Dividir, ordenar i mesurar, un conjunt de ADN amb tamanys diferents, que es troben en una dissolució. (tot i que aquesta tècnica no és usada únicament per a ordenar l’ADN, sinó que també es útil per a d’altres molècules, com les proteïnes).
CONEIXEMENTS PRÈVIS:
Abansde començar la pràctica, hem de saber, que el gel, es el filtre, on separarem les molècules d’ADN, el qual, és una espècie d’esponja, feta de gelatina, amb una gran quantitat de petites perforacions.

ETAPA 1: ELABORACIÓ DEL GEL
MATERIALS:
Agarosa
Matràs Erlenmeyer
Motlle del gel
Raspall del gel
Tampó
Microones


PROCEDIMENT:
1. Posar una mica d’agarosa amb una cullereta al matràsErlenmeyer.
2. Afegir-hi la solució tampó, la qual al ser una dissolució aquosa de sals permetrà que la corrent elèctrica circuli per dintre, tapar-ho amb un embolcall de plàstic i ficar-ho al microones.

3. Escalfar fins que l’agarosa s’hagi dissolt amb la solució tampó, un cop retirat el matràs del microones, treure-l’hi la tapa i abocar la dissolució al motlle del gel. (el motlle del geltindrà cinta adhesiva tancant els seus extrems per retenir la dissolució d’agarosa)

4. Ficar el raspall del gel de manera que els extrems s’aguantin pel costat del motlle del gel.


5. Esperar a que es refredi i es solidifiqui. Un cop solidificat, retirar el raspall amb molt de compte, de manera que quedaran uns forats buits on es ficarà l’ADN.
ETAPA 2: PREPARACIÓ DE L’INSTRUMENTAL
MATERIAL:Gel ( el prèviament preparat)
Cubeta d’electroforesis
Botella amb solució tampó

PROCEDIMENT:
1. Abocar la solució tampó a la cubeta d’electroforesis.
2. Retirar els extrems de cinta adhesiva del motlle del gel i introduir-lo a la cubeta d’electroforesis fent que quedi una mica submergit per la solució tampó.
*la solució tampó condueix el corrent elèctric des d’un extrem del gel fins al’altre i evita que el gel s’assequi durant l’experiment
ETAPA 3: CARGA DE LA MOSTRA D’ADN AL GEL
MATERIAL:
Tampó de carga
Tub amb la mostra d’ADN
Patró de mides d’ADN
Micropipeta
Cubeta d’electroforesis amb el tampó i el gel
Puntes de pipeta

PROCEDIMENT:
1. Afegir una mica de tampó de carga, utilitzant la micropipeta, a la mostra d’ADN.
*Les mostres d’ADN es preparen en una solucióincolora. El tampó de carga permet veure fàcilment la mostra, ja que conté colorant, també al seu lleugerament dens fa que la mostra caigui pels forats del gel i no floti i surti. El patró de mida de l’ADN ja conté el tampó de carga
2. Aspirar una mica de mostra d’ADN amb la micropipeta i ficar-la al primer forat del gel.
3. Agafar la micropipeta i aspirar una mica de patró de mida de l’ADN i ficar-loal següent forat lliure del gel.
*El patró de mida de l’ADN conté molècules d’ADN de longitud coneguda que al sotmetre-les a la electroforesis ens permet calcular la longitud d’ADN de la mostra.

ETAPA 4: CONEXIÓ DE LA CORRENT ELÈCTRICA I DESENVOLUPAMENT DE LA ELECTROFORESIS.

PROCEDIMENT:
1. Connectem el corrent, tenint en compte, que en el cable negre, es generarà una càrrega negativa,mentre que en el cable vermell, una de positiva.
a. Aquestes diferències de potencial, faran que la corrent passi a través del gel, i com sabem que el ADN té una càrrega negativa, per a aconseguir que es mogui, haurem de connectar el cable negre, en el costat més pròxim a on hem col·locat les mostres, ja que d’aquesta manera, les càrregues es repel·liran i començaran a desplaçar-se.




b. Podemobservar, que de els elèctrodes, es desprenen una sèrie de bombolles, i gràcies a aquestes sabem que el corrent està corrent.






c. El ADN, és atret per la càrrega positiva del elèctrode, i avança fins a l’altre extrem. Les molècules de tamany més curt, avançaran més ràpidament que no pas les llargues, de tal manera que finalment les curtes arribaran més lluny del punt de partida...