Electroforesis

ELECTROFORESIS
La electroforesis es la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico; estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo (electrodos - y +), en dependencia de una combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional.
Es de destacar que a escala analítica, los métodos electroforéticos son de alta sensibilidad, poder de resolución yversatilidad, y sirven como método de separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculas, donde aportan un potente criterio de pureza. Se pueden conocer también mediante estas técnicas, las características ácido-básicas de las proteínas presentes en un extracto crudo, lo que da la información necesaria si se pretende realizar una separación cromatográfica basada en diferenciasde carga. Es útil además para determinar otros parámetros como peso molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de las proteínas.
Electrofóresis en gel de poliacrilamida (PAGE)
La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis en gel, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma,además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada el tamaño del poro.3
Formación del gel de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizaciónvinílica del monómero acrilamida y del monómero entrecruzador N, N'-metilen-bis-acrilamida (Fig. 12). La polimerización se inicia con la formación de radicales libres del monómero, que se producen por radicales libres de oxígeno, por causa de la acción de iones persulfato. Las aminas terciarias como el N, N, N, N´-tetrametilen-diamina (TEMED) se emplean como catalizadores de esta reacción, porquecausan la formación de radicales libres del persulfato. Esta reacción es fuertemente inhibida por altos niveles de oxígeno, por lo que la solución debe ser desgasificada para lograr una formación de gel reproducible.
Hay muchos factores que desempeñan una función importante en la separación electroforética, como son pH, fuerza iónica, gradiente de potencial, tiempo de corrida, concentraciones deacrilamida y bis-acrilamida, etc. Las condiciones óptimas de una buena separación, en la práctica se determinan experimentalmente, con el análisis de cómo influyen los diferentes factores en la electroforesis en cuestión. La naturaleza de la muestra sirve de guía para alcanzar las condiciones en la que se deben obtener los mejores resultados. Durante la polimerización del gel a temperaturasinferiores a 17 ºC, la iniciación del control catalítico y el tiempo de elongación de la cadena comienzan a ser diferencialmente controlables.

La concentración de acrilamida (% T) representa el porcentaje en peso del monómero total empleado (acrilamida + entrecruzador en gramos por 100 mL) y determina la longitud promedio de la cadena del polímero. La concentración de bis acrilamida (% C) representael porcentaje de este monómero en el gel y determina el grado de entrecruzamiento.
La estructura del gel comienza a ser evidente a 4 % T; 0,2-5 % C. Los factores que gobiernan la talla del poro del gel son complicados, pero en general el tamaño del poro disminuye con el incremento del % T. Las proporciones en que ambas se encuentran determinan las propiedades físicas del gel como su densidad,elasticidad, resistencia mecánica y el tamaño del poro. En general se recomiendan valores de T de 5 a 15 % y de C de 2 a 4 %. Para separar moléculas por tamaño, es necesario tomar en cuenta la relación entre el poro efectivo del medio y el tamaño de la molécula que se pretende separar. Si el poro del medio es significativamente mayor que la molécula, la separación electroforética será sobre la base...