electroforesis



LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

GUIAS DE LABORATORIO
2013
GL-UJTL Versión 1



Elaboró Julio Martínez, monitor de laboratorio. Reviso y aprobó, Javier Hernández Fernández, profesor
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III. Electroforesis en geles de agarosa y cuantificación de ADN

1. Objetivo:

Familiarizar a los estudiantes con las técnicas de separación de fragmentos de ADN en un gelde agarosa, en el que los fragmentos migran a diferente velocidad según su peso molecular al ser sometidos a una corriente eléctrica.
Encontrar las diferencias en ADN bacteriano, plasmídico y de hígado de pollo en geles de agarosa.
Determinar la concentración de ADN bacteriano, plasmídico (procariotas) y del hígado de pollo (eucariota) mediante el equipo Nanodrop 1000

2. Definición yAbreviaturas:
2.1. Definición:
Estas técnicas consisten en someter la mezcla de moléculas de ADN embebidas en un gel de agarosa a un campo eléctrico. Las moléculas de ADN son atraídas por el polo positivo debido a la carga negativa de ambas cadenas del ADN, debido a la presencia de grupos fosfato. Las moléculas más pequeñas migran más rápido que las grandes. El nanodrop es un equipo capacitado paramedir pequeñas cantidades de ácidos nucleicos, proteínas y otras moléculas, por medio un espectro de luz que oscilan entre 230 y 280 nanometros (longitudes de onda) determinando la pureza y concentración de las moléculas en ng/μl

2.2. Abreviaturas:
A260-A280: Absorbancia de 260 y 280 nanómetros
ADN: Acido desoxirribonucleico
H2O2: Agua destilada
TBE: Tris/Borato/EDTA
OHBr: Azul deBromofenol
C21H20BrN3: Bromuro de Etidio
UV.: Luz Ultra Violeta
M: Molar
mM: Milimolar
gr: Gramos
ml: Militros
µl: Microlitros
V.: Voltios
min: Minutos
s.: Segundos
°C: Grados Centigrados

3. Preparación de Reactivos:
Acido Diaminoetanol- Tetra Acético (EDTA):
En una probeta de 100 ml adicione 168.1 gr EDTA y disuélvalo con 800 ml de agua destilada; agitar vigorosamente hasta que elprecipitado desaparezca, no olvide ajustar el pH con NaOH a 8; llevar a 1000 ml.

Solucion Buffer TBE 0.5X:
En un balón aforado de 2000 ml mezcle: 50 g de Tris Base, 27.5 g de ácido bórico y 20 ml de EDTA a 0,5 M pH 8.0 y complete el volumen con agua destilada hasta 2000 ml

Azul de Bromofenol (Buffer de Carga):
En un tubo falcón de 50 ml mezcle: 0.125 gr de azul de bromofenol, 20 gr de sacarosa ycomplete con agua destilada a 50 ml.

Bromuro de Etidio 5 mg/ml:
Adicionar 0.05 gr de bromuro de etidio en 1 ml de agua destilada estéril, homogenizar bien y adicionarlo en un tubo eppendorf cubierto con papel aluminio. Sellarlo bien hasta que sea usado.

4. Introducción:
La electroforesis en gel es uno de los métodos más utilizados en los laboratorios para separar ácidos nucleicos oproteínas, de acuerdo con su tamaño. Esto se logra por la diferencia de desplazamiento de las moléculas a lo largo de un gel sometido a un campo eléctrico. La carga eléctrica sirve como fuerza impulsora que atrae las moléculas cargadas negativamente hacia el otro extremo del gel que posee carga positiva (Figura1) (Etchart & Lavagna, 2006).
La velocidad de desplazamiento de las moléculas es inversamenteproporcional a su tamaño. En los ácidos nucleicos la carga está dada por los nucleótidos, por lo que el tiempo que tardará la molécula en atravesar el gel será directamente proporcional al número de nucleótidos que tenga, es decir a su tamaño. De esta manera, para un tiempo determinado las moléculas más grandes quedarán más retrasadas en el gel que las moléculas más pequeñas (Martini et al.,2006).


Figura 1. Esquema del proceso de preparación del gel de agarosa hasta el corrido en el campo de electroforesis en una cámara horizontal (Herveg & Barcia-Macay, 2006)

La cuantificación del ADN se realiza mediante espectrofotometría utilizando el rango de luz UV. Debido a los anillos presentes en las bases nitrogenadas del ADN, esta molécula tiene absorbancia máxima a 260 nm. Para...