Electroforesis

Introducción
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use.
La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz que esempleada para desplazar las moléculas a través del gel. Al situar las moléculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial eléctrico, las moléculas se mueven a diferentes velocidades, hacia el cátodo, si están cargadas positivamente, y hacia el ánodo, si están cargadas negativamente (en una electroforesis, los electrodos se comportan igual que en una cubeta electrolítica). Así, por ejemplo, cuandose aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados negativamente lo harán migrar hacia el ánodo (Westermeier, 1997).
En los ácidos nucleicos la dirección de migración es del electrodo negativo al positivo, y esto es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azúcar-fosfato. En los fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble hélice) la velocidadde migración es inversamente proporcional a su tamaño.
*Experimentos de biología molecular (1): electroforesis octubre 16, 2008. oldearth.wordpress.com/.../experimentos-de-biologia-molecular
Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración mediante un análisiscomparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes fluorescentes actúan mediante inserción entre las pares de bases que conforman el ácido nucleíco. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualización de ADN y ARN. Sin embargo, éste es un reactivo altamente tóxico, con propiedades mutagénicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En laactualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis.
*Duina Posso Duque, Thaura Ghneim Herrera. 2008. Uso de Marcadores Microsatélites para la Estimación de Diversidad Genética en Plantas. Ediciones IVIC.

Material y Equipo
• Camaraelectroforética.
• Generador de electricidad con capacidad de 500v.
• Transiluminador ( ilumiacion ultravioleta)
• Bandeja formadora de gel cn sus repectivos peines
• Micropipetas
• Erleneyer
• Bloque térmico

Reactivos:
• Agarosa al 1% : La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacárido lineal (con un peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repetición de launidad básica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6- anhidrogalactosa. La agarosa es muy frágil y las manipulaciones pueden destruirla con facilidad.

• TBE buffer, 10x.

• Disolución tampón formada por Tris, acetato y EDTA, de uso frecuente en electroforesis, en especial en gel de agarosa para separar ácidos nucleicos. Se dispone de varios tipos de tampones para laelectroforesis de ADN nativo bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentración de aproximadamente 50 mM (pH 7,5 – 7,8).
El Tris es la molécula responsable del tamponamiento (regulación del pH).
El acetato contribuye a ajustar el pH deseado e igualmente a mantenerlo.
El EDTA es un quelante de cationes divalentes cuya función essecuestrar el Mg2+, con lo que se evita que las posibles nucleasas presentes degraden los ácidos nucleicos de la muestra (la mayoría de las nucleasas requieren Mg2+ como coenzima).
El TBE se utilizaba inicialmente a una concentración de trabajo de 1x en el caso de la electroforesis en gel de agarosa.

El buffer de carga se emplea con tres fines:
* aumentar la densidad de las muestras para...