Electroforesis

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS (SDS-PAGE)








OBJETIVOS


Medir las distancias de migración de las proteínas.
Graficar log del peso molecular de los estándares versus migración.
Determinar el peso molecular de cada una de las proteínas de la muestra.


INTRODUCCIÓN


La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad deseparar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa [1]. Cada molécula se desplaza en el campo eléctrico alcanzando una velocidad constante. En el estado estacionario, la fuerza impulsora (fuerza del campo eléctrico) se equilibra con la resistencia al avance (fuerza de fricción hidrodinámica) en el medio en que se desplaza.
Se define la movilidad electroforética comola velocidad de desplazamiento por unidad de campo eléctrico. En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de cada molécula define su comportamiento y separación en el espacio. Diferentes moléculas tendrán diferente movilidad electroforética en un medio determinado. Como medios de soporte se pueden utilizar papel, acetato de celulosa, geles de almidón, geles deagarosa o geles de poliacrilamida.
Los geles de poliacrilamida son el resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Uno de los métodos de electroforesis más comúnmente aplicado para proteínas es el que emplea geles de poliacrilamida. Esta técnica es conocida como SDS-PAGE. Para ello se prepara un gel en placa vertical [2].
En la electroforesis en gel depoliacrilamida con SDS, la separación de proteínas se hace en función de la masa molecular. Tanto es así que la representación del logaritmo de la masa molecular frente a la distancia migrada obedece a una línea recta para gran número de proteínas. Para que esta dependencia sea correcta, es


preciso romper los puentes disulfuro intra- e intercatenarios, para lo cual es frecuente añadir durante

lapreparación de la muestra un agente reductor. De este modo, la masa molecular observada corresponde a la de cada subunidad de una proteína, no a la proteína completa, al existir una relación lineal [3].



REACTIVOS Y MATERIALES

Solución de Acrilamida-Bisacrilamida (40%) comercial.
Tris-HCl 1,5 M pH 8,8.
Tris-HCl 0,5 M pH 6,8.
10% SDS.
10% APS.
TEMED.
Buffer Tris-glicina.
Solución teñidora.
Solucióndesteñidora.
Agua destilada.
Sistema de vidrios, soportes y cámaras de electroforesis de BioRad.
Guantes, micropipetas p 1000 y puntas adecuadas.



PARTE EXPERIMENTAL


Gel Separador (realizado por el profesor) Vol. Final 5 mL.


Acrilamida-Bisacrilamida (40%)
1,5 mL
1,5 M Tris-HCl pH 8,8
1,25 mL
APS 10%
50 uL
SDS 10%
50 uL
H2O
1,15 mL
TEMED
2,5 mL

Gel Concentrador (realizado por el profesor)Vol. Final 3 mL.

Acrilamida-Bisacrilamida (40%)
425 uL
0,5 M Tris-HCl pH 6,8
375 uL
APS 10%
30 uL
SDS 10%
30 uL
H2O
2,89 uL
TEMED
3 uL

Armado de Geles.

Limpiar las placas con etanol y armarlas fijándolas en los soportes para ello. Agregar el gel separador, luego agregar isopropanol por las paredes y dejar gelificar por 20 minutos. Eliminar el isopropanol y agregar el gel concentrador sobre elgel separador, colocando peineta de 10 bolsillos. Dejar gelificar 20 minutos y envolver en toallas de papel humedecidas y Alusa plast y guardar a 4 °C

Preparación y aplicación de la muestra.

Mezclar 20 uL de la muestra de proteínas con 20 uL de buffer de carga y hervir por 5 minutos. Después cargar 20 uL por carril, incluyendo un carril cargado con 3,5 uL de estándares de peso molecularpreteñidos.

Corrida Electroforética.

Conectar los electrodos y aplicar 130V constantes por 1 hora y 30 minutos. Luego detener la corrida y sacar el gel del tanque de electroforesis, separando las placas para obtenerlo.

Tinción.

Sumergir el gel en la solución teñidora e incubar por 30 minutos a 60°C, luego trasladar a la solución desteñidora e incubar hasta que el fondo aparezca claro.



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