Elisa y microelisa

MÉTODO DE ELISA

El método ELISA es el elegido mayoritariamente para el análisis de micotoxinas debido a su rapidez y a la sencillez de la preparación de la muestra.
La técnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemploun colorante, puede ser medido espectofotométricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificaciónde la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas,...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (Radio Inmuno Ensayo) hormonal.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos,búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc...
Desde su presentación en 1971, los ensayos inmunoenzimáticos se han aplicado ampliamente en investigación básica, diagnóstico clínico y en el campo de la biotecnología. La adaptación de la técnica de ELISA a las placas de microtiter ha sido clave para el desarrollo contínuo de numerosas aplicaciones. Tanto antígenos como anticuerpos pueden ser detectados ycuantificados de forma rápida y específica. Paralelamente, se ha ido desarrollando la instrumentación necesaria para poder automatizar al máximo estos ensayos, de forma que se pueden realizar un número muy alto de análisis, en un tiempo corto y con un coste mucho menor al de otras técnicas analíticas.

Fases de un ensayo ELISA
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
Conjugacióndel anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.
Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticostratados que tienen gran afinidad por proteínas.

Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir unoo más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.

Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todas las moléculasmarcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría. En el esquema se muestra la reacción asociada a un ELISA directo.

Enzimas utilizadas en el enzimoinmunoanálisis.
Puesto que la calidad de los métodos inmunoanálisis depende en gran medida de las enzimas utilizadas, éstashan de cumplir ciertos requisitos para que puedan ser utilizadas como marcadores. La actividad catalítica es medida básicamente mediante la medida espectrométrica, fluorimétrica o luminométrica del producto formado. Aunque la fosfata alcalina y la peroxidasa pueden ser medidas con mayor detectibilidad por fluorimetría y luminometría que por espectrometría, el límite de detección global del...