Elisa

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTADE DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
Inmunología general
Grupo: 01 Equipo: 02

Práctica no. 8.

Prueba de ELISA



Introducción.

Elisa.EIA heterogéneo que utiliza como marca enzimas, es una prueba cuantitativa o cualitativa. En el primer caso sirve para medir la concentración (nanogramos o picogramos/ml) de antígenos o anticuerpospresentes en la muestra. En el segundo caso solo se revela la presencia de ellos en una muestra problema y la reacción resulta simplemente positiva o negativa . los reactivos de ELISA cuentan con una vida media larga, pueden automatizarse y no hay contaminación radiactiva. Dándole con esto ventajas sobre RIA.
Para realizar la técnica de ELISA se requiere contar:
* Fase solida: Es donde el Ag oAc pueden estar absorbidos en superficie mediante interacciones hidrofobias. Los materiales más usados son: poliestireno, cloruro de polivinilo (PVC), nylon, polipropileno, nitrocelulosa, goma de silicona y vidrio; que pueden encontrarse comercialmente como microplacas de fondo plano, tubos o perlas.
* Cuando a una fase solida se le absorben los Ac, se está buscando al Ag en la muestraproblema, por ejemplo en la detección del Ag de su superficie de hapatitis B (HBAg), en cambio cuando se ha adherido los Ag en la muestra problema, por ejemplo en la búsqueda de Ac contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
* Bloqueador: se utiliza para bloquear los sitios libres de la fase sólida para evitar que durante la reacción algunas moléculas de reactivo se unan inespecíficamentea la fase solida, en lugar de hacerlo por medio de la reacción Ac-Ag, dando lugar a resultados falsos y se observa un exceso de actividad enzimática que no es real. Para ello, se puede usar un exceso (0.1 al 1%) de una proteína inerte. Entre el bloqueadores más usados esta la caseína, seralbúmina bovina gelatina suero, entero y leche entera (sveltex).
* Conjugado: es la unión de la enzimaa un Ac o Ag en forma covalente, dando como resultado complejos Ag-enzima sin que se pierda la actividad inmunológica o enzimática. La técnica mas usada para conjugar es la Avrameas o del gluteraldehido.
* Enzima y sustrato: son los indicadores de la reacción Ac-Ag ha ocurrido, de ellos depende la sensibilidad total del ensayo, logrando esta cuando se conocen los requerimientos de la enzima.Es sustrato generalmente es incoloro y el producto de la reacción enzimática debe ser fácil y sensiblemente detectable, debido al desarrollo de color, sea fluorescente o que emita luz.

La presencia del producto indica la prueba positiva desde el punto de vista cualitativo. Para hacer un ensayo cuantitativo, se determina la cantidad de enzima absorbida (por su actividad sobre el sustrato paradar un producto colorido, fluorescente o luminoso) la cual es proporcional a la cantidad de Ag-Ac en la muestra, entonces su concentración se puede medir mediante una curva de calibración utilizada estándares de concentración conocida.
Las técnicas de ELISA se pueden realizar de 4 maneras diferentes: (1) directo, (2) indirecto, (3) sándwich y (4) por competencia.
ELISA directo: consiste en laabsorción pasiva de un Ag(o un Ac) sobre la superficie de la placa y posteriormente la adicción de Ac (o Ag) que lleva conjugada la enzima.

ELISA indirecto: (para la detección de Ac) consiste en absorber pasivamente el Ag sobre la placa, adicionar el suero donde se busca los Ac específicos contra Ag y posteriormente añadir un segundo anticuerpo anti-gamma globulina que lleva conjugada unaenzima.

ELISA tipo sándwich: (para la detección de Ac) puede ser directo o indirecto. El primero consiste en absorber los Ac específicos a la placa, después añadir la muestra que contiene el Ag y finalmente un segundo anticuerpo (dirigido contra Ag) que tiene la enzima conjugada. Rl indirecto, utiliza un segundo Ac (contra el mismo Ag) no conjugado y en un paso siguiente un tercer Ac anti-gamma...