Elisa
Páginas: 9 (2024 palabras)
Publicado: 4 de agosto de 2010
La técnica de ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) es utilizada para la detección de muy diversas moléculas biológicas, basándose en la especificidad del reconocimiento antígeno-anticuerpo y en la sensibilidad de las pruebas enzimáticas.
El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tantoinmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de unespectrofotómetro o un colorímetro. Esta técnica es ampliamente empleada en el área médica para la cuantificación de moléculas especialmente de aquellas que experimentan cambios en diferentes estados como pueden ser infecciones por bacterias, virus, hongos o parásitos o fases activas de enfermedades autoinmunes. Como ejemplo se pueden medir por ELISA hormonas, autoanticuerpos, inmunoglobulinascontra antígenos de patógenos, toxinas, antígenos. Las técnicas de ELISA son también muy usadas en los ensayos de nuevos medicamentos para comprobar sus efectos cuantificando las moléculas de interés en cada caso.
Fases de un ensayo ELISA
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes :
|Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). Elanticuerpo| |
|conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc.. El antígeno marcado se | |
|emplea en ensayos de competición de antígeno. | |
|Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con ||
|facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. | |
|Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar| |
|mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario ||
|anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la | |
|amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En | |
|el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan||
|diferentes relaciones de antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de | |
|competición del antígeno. | |
|Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no | ||fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se | |
|lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría. En el esquema se muestra la reacción asociada a | |
|un ELISA directo. | |
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|Tipos de ELISA | |
|• Anticuerpos...
El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tantoinmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de unespectrofotómetro o un colorímetro. Esta técnica es ampliamente empleada en el área médica para la cuantificación de moléculas especialmente de aquellas que experimentan cambios en diferentes estados como pueden ser infecciones por bacterias, virus, hongos o parásitos o fases activas de enfermedades autoinmunes. Como ejemplo se pueden medir por ELISA hormonas, autoanticuerpos, inmunoglobulinascontra antígenos de patógenos, toxinas, antígenos. Las técnicas de ELISA son también muy usadas en los ensayos de nuevos medicamentos para comprobar sus efectos cuantificando las moléculas de interés en cada caso.
Fases de un ensayo ELISA
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes :
|Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). Elanticuerpo| |
|conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc.. El antígeno marcado se | |
|emplea en ensayos de competición de antígeno. | |
|Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con ||
|facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. | |
|Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar| |
|mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario ||
|anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la | |
|amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En | |
|el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan||
|diferentes relaciones de antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de | |
|competición del antígeno. | |
|Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no | ||fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se | |
|lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría. En el esquema se muestra la reacción asociada a | |
|un ELISA directo. | |
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|Tipos de ELISA | |
|• Anticuerpos...
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