En La PCR A Tiempo Real

En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea en el
mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior. Además, mediante detecciónpor fluorescencia
se puede medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de
fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADNformado. Esto permite conocer y
registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación. Los termocicladores para llevar a cabo la
PCR a tiempo real incorporan un lector defluorescencia y están diseñados para poder medir, en cualquier
momento, la fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde se realice la amplificación. Los sistemas de
detección por fluorescencia empleadosen la PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos:
- Agentes intercalantes: Son fluorocromos que aumentan notablemente la emisión de fluorescencia
cuando se unen a ADN de doble hélice. El más empleadoen PCR a tiempo real son SYBR Green y Eva
Green. El principal inconveniente es su baja especificidad, debido a que se unen de manera indistinta a
productos generados inespecíficamente o a dímeros decebadores, muy frecuentes en la PCR.
- Sondas de hibridación específicas: Son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y un
aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energíafluorescente mediante resonancia (FRET) entre
las dos moléculas. Las más utilizadas son:
a. Sondas de hidrólisis. Son oligonucleótidos marcados con un
fluorocromo donador en el extremo 5’ que emitefluorescencia al ser
excitado y un aceptor en el extremo 3’ que absorbe la fluorescencia
liberada por el donador. El espectro de emisión de la primera se ha de
solapar con el espectro de absorción de lasegunda. Mientras la sonda
está intacta, la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el
aceptor. Sin embargo, durante la amplificación de ADN diana, la sonda
se hibrida con su cadena...