Endosporas

I.- Introducción
En esta práctica se buscó la visualización de endosporas diferenciadas del cuerpo celular facilitado por tintes y métodos especiales. Para ellos se utilizaron muestras de bacterias del género Bacillus (descartando las del género Clostridium por ser patógenas y carecer de experiencia para manipularlas con seguridad). Se tiene en cuenta que la endospora es resistente acondiciones extremas de alta temperatura o bajo acción de agentes químicos y puede sobrevivir por largos periodos en ambientes desfavorables. Aun así esporulación no es debido a estas condiciones, sino que se forman en cierto período del desarrollo de la célula. La posición de la espora puede ser central, subterminal o terminal y de forma redonda y ovalada.
En esta oportunidad empleamos dos técnicaspara la tinción de endosporas, la técnica de Dörner, donde se usa la carbolfucsina para teñir la espora, nigrosina como agente decolorante y de tinción negativa, obteniendo como resultado teórico a la espora teñida de rojo, la el resto del cuerpo bateriano incoloro y el escenario de fondo de un color oscuro. En la técnica de Schaeffer y Fulton se emplea carbolfucsina para teñir la espora,alcohol ácido como decolorante y verde malaquita como colorante de contraste; en teoría la espora se tiñe de rojo y la parte vegetativa queda de verde.

II.- Objetivos
a) Distinguir a través de dos técnicas de tinción diferencial la presencia de endosporas bacterianas y diferenciarlas de las estructuras vegetativas normales.
III.- Procedimiento
1.- Técnica de Dörner
Materiales
*Cultivos de Bacillus sp.
* Asa de kölle
* Baño de agua a 100°C
* Láminas porta objeto
* Soluciones colorantes: Carbolfucsina, tinta china (nigrosina).
* Tubitos con agua destilada estéril
* Aceite de inmersión
Procedimiento
1. Se realiza una suspensión concentrada del organismo en 0,5 ml de agua destilada estéril contenida en un tubito de prueba.
2. Se añade 0,5 ml decarbolfucsina y se coloca el tubo en un recipiente con agua hirviendo, durante 15 minutos.
3. Se transfiere una gota de la suspensión de células hervidas a una lámina porta objetos.
4. Se agrega una gota de tinta china y se extiende mediante la técnica del frotis, la mezcla hasta obtener una delgada película.
5. Se seca la lámina al aire o con un papel secante. Y está lista paraanalizarse.
2.- Técnica de Schaeffer y Fulton
Materiales
* Cultivos de Bacillus sp.
* Aceite de inmersión
* Asa de kölle
* Láminas porta objeto
* Mechero con alcohol
* Pinzas
* Soluciones colorantes: Carbolfucsina, Verde malaquita
* Solución decolorante: Alcohol ácido
Procedimiento
1. Se prepara una muestra fija del microorganismo proporcionado.
2. Seagrega a la preparación carbolfucsina en exceso.
3. Con ayuda de una pinza, se hace calentar la lámina con el colorante haciéndola pasar ligeramente por la llama del mechero hasta observar el desprendimiento de vapores.
4. Se mantiene esta condición durante 2 minutos, evitando que el colorante seque o entre en ebullición, añadiendo más colorante de ser necesario a la muestra, si es que elcolorante empieza a desaparecer de la lámina.
5. Se lava el exceso de colorante con agua destilada.
6. Se lava con alcohol ácido(decolorante) la lámina con 5 o 6 gotas.
7. Inmediatamente después de echar el decolorante, se enjuaga con agua.
8. Se cubre la preparación con unas gotas de verde malaquita dejando que actúe por dos minutos.
9. Se enjuaga con agua.
10. Se seca lalámina al aire o con el papel secante. Y está lista para analizarse.

IV.- Observaciones





V.- Discusiones
* Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Esta sucesión ordenada de capas muy hidrofóbicas hace que las esporas brillen de manera intensa al ser observadas por el microscopio (fenómeno llamado...