Ensayo de migracion

ENSAYO DE MIGRACIÓN
Notas: Primero se estandariza la cantidad máxima de inhibidor arac a la que este funciona y no mata las células y de suero y leptína la mínima para que ejerza su efecto “checaresto a fondo”.

0.- Antes de hacer el ultimo pase de células, marcar con 3 lineas cada posillo en la caja de cultivo, la central se hace de esquina a esquina y las 2 laterales se deja un espacio.1.- Desinfectar la campana de extracción con benzal así como el material que se utilizara:

Materiales y reactivos
* Tubos falcon de 15 mL de acuerdo a la cantidad de pocillos.
* Pipetas* Puntas (los 3 anteriores están a un lado de la campana de extracción)
* Una regla o tarjeta(guía para el corte)
* Caja vial(estufa incubación)
Reactivos:
* Arac ( se encuentra en lapuerta pequeña “congelador” del refri blanco)
* Estrógeno ( se encuentra en la puerta grande del refri blanco)
* Leptína ( se encuentra en la puerta grande del refri blanco) esta a 125ng/φL* Vehículo ( se encuentra en la puerta grande del refri blanco)
2.-Se preparan los tubos con cada uno de los experimentos a realizar,rotulandolos.

Tubo 1: 12 mL DMEN 1%+6 φL Arac (que seránrepartidos en 2 mL por placa)
3.-Se hace una incisión con una punta de pipeta estéril (cuidar que la fuerza sea solo la necesaria para realizar el corte)
4.-Se hace un lavado con 1 mL PBS a cada placacuidadosamente. Homogenizar para quitar las células muertas y desechar.
4.- En los tubos preparados, agregar los reactivos a las concentraciones deseadas, inclinado el tubo. Homogenizar y verter elcontenido a la placa con cuidado cuidando el orden de cada tubo
Tomar foto a la hora cero y aquellos tiempos deseados.
Experimento: Células MDA(ejemplo)

Lep= Leptina (lep) 50ng/mL
Leptina (lep)50ng/mL
Leptina (lep) 50ng/mL
Estrogeno 0.1 φM
Estrogeno 0.1 φM
Lep+Estrogeno 0.1 φM
Lep+Estrogeno 0.1 φM
Lep+Estrogeno 1 φM
Lep+Estrogeno 1 φM
Estrogeno 1%
Estrogeno 1%
Vehiculo
Vehiculo...