Ensayo de proliferación / supervivencia / toxicidad mediante MTT

ENSAYO DE PROLIFERACIÓN CELULAR CON MTT
Se trata de un ensayo colorimétrico basado en la reducción del tetrazolio (MTT o bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio) aformazán insoluble, un producto coloreado de tonalidad azul que puede ser solubilizado mediante disolventes orgánicos y cuantificado espectrofotométricamente. La reducción del MTT es llevada a cabo porlas deshidrogenasas mitocondriales de las células vivas de forma que la viabilidad celular es proporcional a la densidad óptica del formazán producido.
Protocolo
1. Preparar una suspensióncelular de 6104 células/ml en medio de cultivo.
2. En una microplaca de 96 pocillos añadir por cuadruplicado:
a) Para el blanco:
• 100 µl de medio
b) Para el control:
• 50 µl de medio
• 50µl de suspensión celular
c) Para los tratamientos:
• Preparar los pocillos que sean necesarios, con 50 µl de medio cada uno, conteniendo una concentración conocida del agente a ensayar preparadamediante diluciones seriadas en el medio.
• 50 µl de suspensión celular.
3. Incubar durante 3 días a 37 ºC en atmósfera húmeda y 5% de CO2.
4. Añadir 10 µl por pocillo de una solución de MTTen PBS (5 mg/ml).
5. Incubar durante 4 h.
6. Solubilizar el precipitado cristalino con 150 µl por pocillo de una solución de isopropanol ácido (HCl 0,04 N en isopropanol).
7. Determinar ladensidad óptica a 550 nm con referencia a 630 nm en un espectrofotómetro para microplacas.
Expresión de los resultados
Los resultados se expresan como % de supervivencia respecto al control sintratar. Es muy útil el cálculo de la concentración inhibidora 50 (IC50), concentración del compuesto que permite la supervivencia del 50% de la población celular.
Nota:
Cuando se quierananalizar células en estado poco proliferante se preparará una suspensión celular madre de 6105 células/ml. Además, el medio de cultivo se suplementará con un 2% de FBS en lugar de un 10%.