Ensayo Enzimatico

Trabajo práctico n°5
Enzimas

Objetivos Generales:
Caracterizar cinéticamente la enzima fosfatasa alcalina y determinar el efecto de factores ambientales (pH, Temperatura y presencia de productos) sobre la actividad enzimática.
Objetivos específicos:
-Realizar una curva de calibración de pNP.
-Determinar la vel. Máxima de la enzima.
-Determinar el efecto del pH sobre la actividad de laenzima.
-Determinar el efecto de la t° sobre la actividad de la enzima.
-Determinar el efecto de la presencia de producto sobre la actividad de la enzima.

Resultados
Actividad n°1: Curva de calibración
A405 | A405 corregida | pNP µM |
0,062 | 0 | (Blanco)0 |
0,132 | 0,07 | 20 |
0,203 | 0,141 | 40 |
0,224 | 0,162 | 60 |
0,317 | 0,255 | 80 |
0,379 | 0,317 | 100 |
0,446 | 0,384| 120 |

La curva de calibración recién presentada al compararla con la de nuestros compañeros presenta absorbancias que son aproximadamente la mitad de lo que corresponde, por lo tanto utilizaremos la curva de el grupo MAZ que se presenta a continuación para realizar las interpolaciones de la absorbancias obtenidas de las demás actividades.
Nos dimos cuenta de este error al analizar lasinterpolaciones de la actividad y encontrar incoherencia con la magnitud de las concentraciones, por lo que decidimos averiguar con otros grupos obteniendo la respuesta al problema que se había presentado, la curva de calibración estaba mal hecha, ahondaremos en el porqué de este error en la discusión.
Curva grupo MAZ:
pNP µM | A 405 | A 405 c |
0 | 0,075 | 0 |
20 | 0,205 | 0,13 |
40 |0,377 | 0,302 |
60 | 0,529 | 0,454 |
80 | 0,672 | 0,597 |
100 | 0,816 | 0,741 |
120 | 0,984 | 0,909 |

Para obtener las concentraciones de productos en las siguientes actividades a analizar utilizaremos la ecuación obtenida de este gráfico:
y = 0,0076x – 0,0071
Donde y corresponde a la absorbancia y x a la concentración de productos.
Nos interesaría mencionar que los datos de la curva decalibración son los únicos que no fueron obtenidos experimentalmente por los propios integrantes del grupo.

Actividad n°2 : Velocidad máxima y Km
pNPP mM | A405 | A corregida | pNP µM | Vi µM/min | 1/Vi | 1/[s] |
0 | 0,068 | 0 | 0 | | | |
0,05 | 0,133 | 0,065 | 18,43421 | 1,228947 | 0,813704 | 20 |
0,1 | 0,239 | 0,171 | 32,38158 | 2,158772 | 0,463226 | 10 |
0,5 | 0,623 |0,555 | 82,90789 | 5,527193 | 0,180924 | 5 |
1 | 0,871 | 0,803 | 115,5395 | 7,702632 | 0,129826 | 1 |
5 | 1,27 | 1,202 | 168,0395 | 11,20263 | 0,089265 | 0,2 |
10 | 0,996 | 0,928 | 131,9868 | 8,799123 | 0,113648 | 0,1 |

Grafico de saturación:

Gráfico de dobles recíprocos:

La ecuación de la línea de tendencia de este gráfico es
y = 0,0363x + 0,0785
Donde “y” corresponde a 1/Vo y“x” corresponde a 1/[S]
El coeficiente de correlación lineal es de 0,9531
Esta ecuación es correspondiente con la ecuación de lineweaver-Buck:
1Vo= KmVmax [s]+ 1Vmax
Así obtenemos que el “n” de nuestra ecuación corresponde a 1/Vmax y la pendiente corresponde a Km/Vamx.
Remplazando podemos obtener los valores precisos de Vmax y Km
1/Vmax = 0,0785
Vmax = 12,73
Ahora que tenemos la Vmax,podemos sacar la Km, ya que como dijimos la pendiente corresponde a Km/Vmax
Km/12,73 = 0,0363
Km = 0,46 mM
Actividad n°3: efecto del pH
pH | A405 | A corregida | pNP µM | AE en pNP µM/min | Log de AE |
9,6 blanco | 0,073 | | | | |
4 | 0,4 | 0,327 | 43,9605263 | 2,93070175 | 0,466971624 |
7 | 0,648 | 0,575 | 76,5921053 | 5,10614035 | 0,708092748 |
9,6 | 0,847 | 0,774 | 102,776316| 6,85175439 | 0,835801786 |

El pH al ser una magnitud logarítmica debemos ajustar los datos a esta propiedad del pH, por lo tanto aplicamos Log a AE en µM/min para ajustar el gráfico.

Actividad n°4: efecto de la temperatura
T°C | A405 | A corregida | pNP µM | AE en pNP µM/min |
37 blanco | 0,073 | | | |
0 | 0,306 | 0,233 | 31,59211 | 2,10614 |
37 | 0,884 | 0,811 |...