Ensayo síntesis de proteína

TRANSLOCACIÓN DE PROTEÍNAS Existen diferentes tipos de síntesis proteica. Por un lado, se puede dar síntesis en el citosol, mientras que por otro se puede dar síntesis de manera conjunta al RE. En realidad, cuando al sintetizar una proteína en el citosol aparece un péptido señal, se continuará la síntesis de manera anexa al RE. La hipótesis del péptido señal la propuso Dobberstein hará unos 20años. Se basó en unos experimentos de síntesis in vitro de Ig. Las proteínas sintetizadas in vitro se desplazaban de manera diferente en el gel, siendo menos veloces. Se supuso entonces que debían sufrir algún tipo de modificación posterior a la traducción. Existe una señal que determina la entrada de una proteína en la ruta de secreción. Cuando al sintetizar la proteína entra el péptido señal ypocos aminoácidos más en el RER, se elimina la señal, en un proceso cotraduccional. El reconocimiento inicial del péptido señal se da por la SRP, signal recognition particle. Esta partícula está compuesta por RNA y proteínas. Tiene la capacidad de reconocer el péptido señal y detener la síntesis de la proteína. La existencia del SRP se demostró mediante la producción in vitro, simulando lascondiciones del RER. Emplearemos microsomas rugosos, que se obtiene mediante homogeneización y posterior centrifugación en gradiente de densidad. Colocamos los microsomas rugosos en una solución con ribosomas libres y todo lo que se requiere para un sistema de traducción in vitro, como mRNA, ATP, buffer, tRNA-AA, factores y Met-S35-tRNA. Ponemos los ribosomas libres para que cojan más rápido el mensajero ylo traduzcan y no tengamos que esperar a que los ribosomas unidos al microsoma acaben la síntesis que estaban realizando, ya que si están unidos al microsoma es que estaban traduciendo.

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Biología Celular

Obtendremos un gel en el que no podremos distinguir si la proteína está situada dentro o fuera del microsoma. Para poder distinguir, si está en el interior o es soluble o está unida ala vesícula, podremos añadir a la solución una proteasa, que sólo podrá degradar la proteína si ésta es accesible para ella, por lo que si está en el interior del microsoma, podremos observar la señal en la autorradiografía. También haremos un control con la proteinaza K y un detergente para permeabilizar la membrana, de manera que si aparece señal la proteinaza no era activa. A la derecha semuestran los resultados de los siguientes experimentos. En 1 tenemos el resultado del experimento anterior, con microsomas rugosos, momento en que aparece la banda, ya que ha habido síntesis proteica y se ha translocado la proteína resultante al interior de la vesícula, donde será inaccesible para la proteinaza. En 2 se emplean microsomas rugosos, pero que se han lavado. En este caso no aparece nada,por lo que en el lavado se ha de haber eliminado alguna sustancia importante para la translocación. En 3 se han empleado microsomas similares a 2, pero que se han incubado con la solución de salino resultante del lavado. En esta caso aparece la banda, por lo que ha de tratarse de alguna partícula soluble. De la solución de salino se pudo aislar la SRP, receptor de la secuencia señal de laproteína, que provoca que se continúe la síntesis en el microsoma. Se trata de un receptor de unión débil al RER. SRP Contiene RNA, de filamento único, que contiene regiones antiparalelas, por lo que se forma un doble filamento, al que se asocian 6 proteínas. Cuando el péptido señal sale por la superficie del ribosoma, SRP lo detecta, y la síntesis se detiene hasta que SRP se une a él. Finalmente SRP sesepara, y el ribosoma libre se une al elemento de translocación. SRP es dependiente de GTP. La entrada de proteínas al RER es por lo tanto dependiente de GTP y de su hidrólisis. GTP es necesario para que se de la unión al translocador del ribosoma, a la vez que es necesaria su hidrólisis para que se libere de nuevo. Existe una proteína, la DP, docking protein, que es la receptora de SRP. Un tipo...