Ensayos Enzimáticos
Páginas: 10 (2282 palabras)
Publicado: 22 de septiembre de 2011
Ensayos Enzimáticos
Para estudiar la cinética es importante crear métodos confiables y reproducibles para la medición de la actividad enzimática en condiciones específicas. El propósito del ensayo enzimático es medir la rapidez de formación del producto o la rapidez de la desaparición del substrato(s) en condiciones controladas de temperatura, pH y concentración de compuestos modificadores dela actividad. Se usan dos tipos básicos de ensayos enzimáticos denominados:
1. Ensayos continuos: en los que el método ofrece una lectura continua de la actividad monitorizando a tiempo real el sustrato consumido o el producto generado.
2. Ensayos discontinuos: en los que la reacción se detiene en un punto y se mide la concentración de los sustratos o los productos.
En cualquiercaso se debe asegurar que la rapidez inicial de la reacción se pueda medir en presencia de una concentración de substrato(s) fija. La rapidez inicial es importante ya que evita complicaciones debidas a la acumulación del producto y porque la enzima puede desactivarse en el curso del ensayo. En estas condiciones, la rapidez medida será directamente proporcional a la concentración de la enzima. Además,la actividad se mide normalmente bajo condiciones de estado estacionario donde la concentración del substrato es mucho mayor que la concentración de la enzima, para que la rapidez difícilmente varíe debido a cambios en la concentración del substrato. Una práctica común es usar una concertación de substrato por lo menos cinco veces mayor que la Km de la enzima del substrato.
Para ensayoscontinuos más complejos se necesita el acoplamiento o enlace de una reacción catalizada por una enzima, la cual puede seguirse de manera continua, con la reacción enzimática que se estudiará.
D-glucosa + ATP D-glucosa-6-fosfato + ADP
Ni los substratos ni los productos absorben a longitudes de onda específicas o tienen propiedades que puedan monitorearse continuamente. Estareacción se puede acoplar a la reducción de NADP al añadir glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en exceso, es decir, a concentraciones que no limiten la rapidez de la reacción:
D-glucosa + ATP D-glucosa-6-fosfato + ADP
NADP
NADPH
D-glucosa-S-lactone-6-fosfato
(6-fosfogluconlactona)
En esta reacción acoplada, la hexocinasa cataliza la formación de D-glucosa-6-fosfato, la cual se reduce inmediatamente por la acción de la glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa para producir NADPH. El NADP+ no absorbe a 340 nm pero el NADPH sí. En consecuencia, la reacción se puede monitorear continuamente a 340 nm.
Estos ensayos acoplados requieren que el producto de la primera reacción, laD-glucosa-6-fosfato, sea convertida de inmediato 6-fosfogluconolactona. Es decir, la reacción acoplada debe proceder con una rapidez mayor que la de la reacción que se desea estudiar cinéticamente. La enzima acoplante debe estar pura, presente en concentraciones no limitantes de la rapidez de la reacción y debe estar libre de impurezas que pudieran afectar la actividad de cualquiera de lasenzimas.
La actividad de la hexocinasa también podría medirse con un procedimiento de ensayo discontinuo en el que la d-glucosa y la hexocinasa se mezclan en condiciones definidas, y las muestras se extraen a intervalos precisos para la determinación de la glucosa. Estos ensayos requieren que las muestras sean extraídas a intervalos precisos y que la reacción sea detenida inmediatamente, por ejemplo,mediante la adicción de ácido tricloroacético para inactivar a la enzima. Siempre que es posible, se prefieren más ensayos continuos que los discontinuos.
Ensayos continuos
Son los más recomendados, si solo que quiere obtener la velocidad de reacción, sin datos adicionales. Existen diferentes tipos como:
Espectrofotométricos: las reacciones catalizadas por enzimas pueden seguirse...
Para estudiar la cinética es importante crear métodos confiables y reproducibles para la medición de la actividad enzimática en condiciones específicas. El propósito del ensayo enzimático es medir la rapidez de formación del producto o la rapidez de la desaparición del substrato(s) en condiciones controladas de temperatura, pH y concentración de compuestos modificadores dela actividad. Se usan dos tipos básicos de ensayos enzimáticos denominados:
1. Ensayos continuos: en los que el método ofrece una lectura continua de la actividad monitorizando a tiempo real el sustrato consumido o el producto generado.
2. Ensayos discontinuos: en los que la reacción se detiene en un punto y se mide la concentración de los sustratos o los productos.
En cualquiercaso se debe asegurar que la rapidez inicial de la reacción se pueda medir en presencia de una concentración de substrato(s) fija. La rapidez inicial es importante ya que evita complicaciones debidas a la acumulación del producto y porque la enzima puede desactivarse en el curso del ensayo. En estas condiciones, la rapidez medida será directamente proporcional a la concentración de la enzima. Además,la actividad se mide normalmente bajo condiciones de estado estacionario donde la concentración del substrato es mucho mayor que la concentración de la enzima, para que la rapidez difícilmente varíe debido a cambios en la concentración del substrato. Una práctica común es usar una concertación de substrato por lo menos cinco veces mayor que la Km de la enzima del substrato.
Para ensayoscontinuos más complejos se necesita el acoplamiento o enlace de una reacción catalizada por una enzima, la cual puede seguirse de manera continua, con la reacción enzimática que se estudiará.
D-glucosa + ATP D-glucosa-6-fosfato + ADP
Ni los substratos ni los productos absorben a longitudes de onda específicas o tienen propiedades que puedan monitorearse continuamente. Estareacción se puede acoplar a la reducción de NADP al añadir glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en exceso, es decir, a concentraciones que no limiten la rapidez de la reacción:
D-glucosa + ATP D-glucosa-6-fosfato + ADP
NADP
NADPH
D-glucosa-S-lactone-6-fosfato
(6-fosfogluconlactona)
En esta reacción acoplada, la hexocinasa cataliza la formación de D-glucosa-6-fosfato, la cual se reduce inmediatamente por la acción de la glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa para producir NADPH. El NADP+ no absorbe a 340 nm pero el NADPH sí. En consecuencia, la reacción se puede monitorear continuamente a 340 nm.
Estos ensayos acoplados requieren que el producto de la primera reacción, laD-glucosa-6-fosfato, sea convertida de inmediato 6-fosfogluconolactona. Es decir, la reacción acoplada debe proceder con una rapidez mayor que la de la reacción que se desea estudiar cinéticamente. La enzima acoplante debe estar pura, presente en concentraciones no limitantes de la rapidez de la reacción y debe estar libre de impurezas que pudieran afectar la actividad de cualquiera de lasenzimas.
La actividad de la hexocinasa también podría medirse con un procedimiento de ensayo discontinuo en el que la d-glucosa y la hexocinasa se mezclan en condiciones definidas, y las muestras se extraen a intervalos precisos para la determinación de la glucosa. Estos ensayos requieren que las muestras sean extraídas a intervalos precisos y que la reacción sea detenida inmediatamente, por ejemplo,mediante la adicción de ácido tricloroacético para inactivar a la enzima. Siempre que es posible, se prefieren más ensayos continuos que los discontinuos.
Ensayos continuos
Son los más recomendados, si solo que quiere obtener la velocidad de reacción, sin datos adicionales. Existen diferentes tipos como:
Espectrofotométricos: las reacciones catalizadas por enzimas pueden seguirse...
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