Ensayos

B-galactosidasa
INTRODUCCION
La beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es una enzima que hidroliza la lactosa en sus monomeros glucosa y galactosa, al escindir el enlace b 1-4 del azucar. Se conoce que la leche, por su alto contenido en lactosa,no puede ser asimilada por cierto grupo de personas, pues les ocasiona trastornos digestivos a causa de que no sintetizan beta-galactosidasa (Bayless et al.,1971).
Por otra parte, en el area industrial los problemas ocasionados por la lactosa se relacionan con la utilizacion del suero de leche y con la manufactura de productos derivados de la leche (Holsinger, 1978), por lo tanto las razones del interes actual por esta enzima son basicamente nutricionales e industriales.
La enzima beta-galactosidasa purificada de K. fragilis presenta mayorestabilidad ante variaciones de temperatura y de la concentracion de iones que la enzima purificada de la especie K. lactis (Mahoney y John, 1978), por lo que resultaria mas conveniente utilizar la primera para la hidrolisis de la leche y productos derivados de ella en la industria alimentaria. El objetivo de este trabajo fue aislar el gen que codifica para la beta-galactosidasa de K. fragilis como unprimer paso para su posterior manipulacion con vistas a obtener un sistema que exprese eficientemente dicha enzima.
MATERIALES Y METODOS
Cepas y medios
La cepa de E. coli MC1061 (F-, araD139, D(ara, leu)7696, DlacY74, galU, galK^+, hsr^-, hsm^+, str^+) se utilizo en todas las transformaciones bacterianas y propagaciones de plasmidios. Esta se crecio a 37^oC en medio LB y se an-adio ampicilina (LBA)a 100 ug/mL. Las cepas de levadura K. fragilis NRRL Y 1109 yK lactis SD11 (lac4-) se crecieron a 28^oC en medio YPG.
Aislamiento de ADN cromosomal
El ADN cromosomal de las celulas de levadura se aislo segun el procedimiento descrito por Philippsen et al. (1991).
Southern-blot
Se realizo de acuerdo con la metodologia descrita por Sambrook et al. (1989).
Transformacion
El metodo detransformacion utilizado para la cepa K. lactis SD11 ha sido previamente reportado (Das et al., 1984).
Construccion de la genoteca
La genoteca se realizo digiriendo el ADN de K. fragilis NRRL Y 1109 con la enzima MboI. Los fragmentos de talla entre 6 y 9 kb se aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusion seguido por extraccion fenolica. Estos fragmentos se ligaron al vectorpUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985) digerido con BamHI y tratado con fosfatasa alcalina (CIP). La mezcla se transformo en la cepa MC1061 y se propago en medio LBA que contenia 5-bromo-4-cloro-3-indolilo-b-D-galactopiranosido (XGAL).

RESULTADOS Y DISCUSION
Aislamiento del gen lactasa de K. fragilis
Despues de haber propagado 17 000 colonias de MC1061 de una genoteca de 80 000 colonias sobremedio LBA con XGAL se observo que cuatro de ellas se colorearon de azul. Estas colonias se aislaron y sus plasmidios se purificaron. Estos plasmidios se nombraron pLACKF1-4 y contenian insertos desde 7 hasta 9 kb. Debian contener el gen lactasa de K. fragilis porque las celulas de MC1061 no pueden expresar la beta-galactosidasa, pero si son capaces de expresar el gen lac4 de K. lactis cuando setransforman con el plasmidio pK16 (resultados no mostrados).
El gen lactasa de K. fragilis complementa el gen lac4 de K. lactis
Un fragmento XbaI-SmaI de 7.5 kb del plasmidio pLACKF1 el cual supuestamente contiene el gen lactasa de K. fragilis se subclono en el plasmidio pKRIB (Sreekrishna et al., 1984) (figura 1). El plasmidio resultante pLACE se utilizo para transformar la cepa de K. lactis SD11.Los transformantes seleccionados en medio YPG que contenia el antibiotico gentamicina (G418) a una concentracion de 100 ug/mL se replicaron sobre medio YPG con XGAL. Todos los transformantes se colorearon de azul, lo que evidencio que el gen de la lactasa de K. fragilis complementa la actividad del gen lac4 de K. Lactis.
Comparacion entre los genes que codifican para la beta- galactosidasa de K....