Ensayos

Prácticas  de LABORATORIO
 
OBJETIVOS GENERALES
Que el alumno conozca:
        Las principales propiedades de las proteínas y que se familiarice con los procesos generales de extracción, identificación y cuantificación de las mismas.
        Que las enzimas constituyen una clase especial de proteínas, que requieren condiciones óptimas de acción, que catalizan reacciones químicasespecíficas y que para su funcionamiento resulta esencial mantener la conformación nativa.
I. PROTEÍNAS
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
        Discutir la importancia de la elección del método de obtención de una muestra.
        Comprender los fundamentos de las técnicas que permiten detectar la presencia o ausencia de proteínas en muestras biológicas.
        Discutir el significado de los términos falsopositivo y falso negativo aplicados a una reacción de caracterización.
        Conocer el significado y la importancia de la expresión sensibilidad del método y discutir las condiciones en que determinado método se puede aplicar.
        Realizar ensayos de caracterización cualitativos de proteínas en diferentes muestras biológicas.
        Realizar la determinación de la cantidad deproteínas presentes en una muestra por métodos colorimétricos: ensayo de caracterización cuantitativo.
        Construir una curva de calibración para proteínas.
1. Extracción y valoración de las proteínas presentes en frutos
Para obtener un determinado componente a partir de un material biológico deben realizarse distintas operaciones, tales como extracción, aislamiento y purificación. La necesidad deefectuar una o más de estas operaciones dependerá del material de partida y de los objetivos perseguidos. Por ejemplo, si se desea determinar el contenido de glucosa en orina, no es necesario realizar ninguna operación previa (salvo las indicadas por el método elegido), ya que este monosacárido se encuentra disuelto en la orina. En cambio, si se desea determinar la concentración de glucógeno encélulas hepáticas de cobayo, necesariamente se deberá:
a)    separar  y disgregar el tejido hepático del animal y
b)    “liberar” el glucógeno de las células, esto es, realizar las operaciones necesarias para extraer el glucógeno hepático.
Asimismo, dependiendo del método de determinación a emplear, será necesario realizar una o varias etapas de separación o aislamiento del glucógeno: separarlode otros componentes celulares que puedan interferir con las determinaciones. Por último, si el objetivo es analizar la estructura del glucógeno, será necesario purificarlo.
        En el presente trabajo práctico se realizará una extracción de las proteínas solubles en medio acuoso que se encuentran presentes en frutos. Luego de la extracción, las proteínas serán separadas de impurezas talescomo azúcares y pigmentos por tratamiento con acetona, que produce la precipitación de las proteínas, las que luego serán redisueltas y posteriormente cuantificadas por el método de Bradford.
2. Reacción del biuret
Fundamento de la reacción
Consiste en tratar una proteína o péptido con Cu++ en medio alcalino, produciéndose una coloración violácea por formación de un complejo de coordinación entreel Cu++ y los pares electrónicos libres de los nitrógenos de los grupos imino de la unión peptídica. Son necesarias por lo menos dos uniones peptídicas para que tenga lugar la reacción.
        Retomando lo visto anteriormente en el trabajo experimental del módulo 2 (ver “algunas consideraciones”), cuando se caracteriza un grupo o familia de sustancias (por ejemplo, caracterización cuali ocuantitativa de proteínas en una muestra problema) o identifica una sustancia en particular (por ejemplo comprobar la presencia de ovoalbúmina en clara de huevo) se debe tener muy en cuenta el objetivo que se persigue. En función de este objetivo se seleccionará el método más indicado.
        La reacción del biuret no es una reacción específica para proteínas. Eso hace que un resultado positivo...