Enzima

Prácticas de Bioquímica I

Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA SANGUÍNEA
Objetivos Al finalizar el trabajo práctico los alumnos estarán en capacidad de: Conocer la forma y condiciones para obtener un preparado de catalasa sanguínea. Verificar el efecto de la concentración de la enzima sobre la actividad de la catalasa sanguínea. Reconocer elefecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. Demostrar la influencia del pH sobre la actividad enzimática. Probar el efecto de la concentración de substrato sobre la actividad de la catalasa sanguínea. Verificar la influencia de un inhibidor sobre la actividad enzimática.

Introducción El metabolismo celular de los tejidos animales y vegetales genera peróxido de hidrógeno (H2O2) moléculaque resulta tóxica para la célula. A través de la evolución estos organismos han desarrollado sistemas enzimáticos que descomponen este peróxido y evitan daños a la célula. Uno de estos sistemas enzimáticos lo representa la catalasa. La catalasa es una cromoproteína porfirínica cuya masa molecular es de 225.000 kDa, contiene cuatro grupos hemo por molécula y su contenido de hierro es 0.9%. Estaproteína presenta actividad enzimática del tipo oxido-reductasa sobre el peróxido de hidrógeno (H2O2) el cuál constituye el sustrato para esta enzima y lo descompone en oxígeno y dos moléculas de agua Su nombre sistemático de acuerdo a la Unión Internacional de Bioquímica es H2O2 oxidoreductasa y cataliza la siguiente reacción:

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Catalasa 2H2O2
Peroxido de hidrógeno

O2 + 2H2O

En los mamíferos esta enzima se encuentra en todo tipo de células, siendo su actividad mayor en el hígado, riñón y eritrocitos. Un mol de catalasa puede descomponer 5.000.000 de moléculas de H2O2 por minuto a 37°C, esto se conoce como número de recambio y representa uno de los más altos de toda la enzimología. La actividad de lacatalasa de los eritrocitos puede determinarse mediante algunos principios bioquímicos de los cuales los más sencillos están basados en la desaparición del H2O2 al incubarlos con preparaciones crudas o purificadas de la enzima. A su vez la desaparición del H2O2 puede estimarse por varios métodos, uno de ellos es el método

titrimétrico por permanganimetría. En este método una preparación decatalasa se incuba
con una concentración conocida de peróxido de hidrógeno durante cierto tiempo y en

condiciones adecuadas. Al cabo de este tiempo, la reacción se detiene por adición de H2SO4 2N y luego se titula con una solución de permanganato de potasio (KMnO4). La reacción de peróxido de hidrógeno con el permanganato de potasio en medio ácido es la siguiente:
2 KMnO4 + 3 H2SO4 + 5 H2O2 K2SO4+ 2 MnSO4 + 8 H2O + 5 O2

Esta reacción constituye una típica titulación de oxidación-reducción, la cual se hace en proporciones estequiométricas entre el permanganato y el peróxido de hidrógeno. Los experimentos que se realizarán en este trabajo práctico, se basarán en el método titrimétrico por permanganimetría y en cada uno de ellos se realizará la titulación de un tubo control, el cuálconstituye una medida de peróxido presente al comienzo del experimento. La titulación de los tubos experimentales representa la medida del peróxido

remanente después que la enzima ha actuado sobre el sustrato. La diferencia entre las dos titulaciones (control – experimental) representa la cantidad de peróxido descompuesto en una unidad de tiempo, es decir, la velocidad de la reacción.

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MATERIALES Y REACTIVOS
Matraces erlenmeyer Tubos de ensayo Embudo Bureta y soporte universal Gradilla Baños de calentamiento Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL. H2SO4 2 N Buffer fosfato 0,01 M, pH 3, 7 y 8. Debe contener H2O2 para gastar aproximadamente 15 mL de KMnO4 0,012 N. KMnO4 0,012 N Soluciones de KCN 10-2 M., 10-3...