enzimas lab1

DEMOSTRACION DE LA ESPECIFICIDAD ENZIMÁTICA



WENDY RODRIGUEZ GARCÍA


DOCENTE:
ELENA GELDRES VIGIL


UNIVERSIDAD PRIVADA DEL NORTE
FACULTAD DE INGENIERÍA
INGENIERÍA AMBIENTAL
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA Y TOXICOLOGÍA
2015

1. OBJETIVOS
1.1 Demostrar la especificidad enzimática de la enzima de glucosa oxidasa sobre la glucosa.

2. INTRODUCCION
La glucosa oxidasa es producida por Penicilliumnotatum. Esta enzima tiene una afinidad extremadamente marcada por la glucosa. En la presente práctica vamos a demostrar la especificidad de la enzima sobre un sustrato. Para ello, emplearemos glucosa y fructosa; dos isómeros que tiene la formula general C6H12O6.
La Glucosa oxidasa (GOD) cataliza la reacción siguiente:
Glucosa + O2 + H2O2 -----GOD-----→ Ácido Glucónico + H2O2.
El H2O2 uno delos productos de la reacción pude ser determinado utilizando la enzima Peroxidasa, la misma que al actuar sobre el H2O2 libera Oxigeno, el cual reacciona con la 4-aminofenazona (4-AF) y el fenol, en forma proporcional a la concentración de H2O2.
La reacción es la siguiente:
2 H2O2 + 4 AF + fenol -----POD----→ Quinona coloreada + 4 H2O.

3. MATERIAL METODOS
3.1 Materiales:
Pipetas
Tubos deensayos
Baño maría
Cocina eléctrica
3.2. Reactivos.
Solución fructosa.
Solución glucosa.
Solución GOD/POD.

4. PROCEDIMIENTO:
4.1. PREPARACION DE 3 SISTEMAS.
Utilizando la tabla a continuación se debe prepara 3 sistemas.
Favor utilizar pipetas individuales por reactivo utilizado (no contaminar pipetas).

Tabla 01: Sistema Experimentales:

COMPONENTES Y PROCESO
SISTEMA (Tubos)

1
2
3
Solución deGlucosa 1 g/L (mL)
-
0.1
-
Solución de Fructosa 1 g/L (mL)
-
-
0.1
Solución GOD/POD (mL)
2.0
2.0
2.0
Incubar a 37 °C por 10 minutos.
Agua destilada (mL)
3.1
3.0
3.0
Mezclar por inversión

Posteriormente leer mediante el colorímetro a 420 nm la absorbancia.








5. ESQUEMA.





















6. RESULTADO

Tubo de ensayo
Composición
Lectura de absorbancia
Promedio de la lectura
Tubo Control
Enzima+ H2O (destilada)
0.346 | 0.348 | 0.348
X0 = 0.347
Tubo 1
Enzima + H2O (destilada)
0.047 | 0.049 | 0.052

X1 = 0.049

Tubo 2
Glucosa + enzima + H2O (destilada)
0.383 | 0.385 | 0.386
X2 = 0.384

Tubo 3
Fructuosa + enzima + H2O (destilada)
0.180 | 0.181 | 0.179
X3 = 0.180






Glucosa = absorbancia problemas * factor
Glucosa = 0.049 * 20.41= 1
Glucosa = 0.384 * 20.41= 7.8374Glucosa = 0.180 * 20.41 = 3.6738









7. DISCUSION.

Los reactivos con los que se trabajan son fructosa y glucosa, ambos tienen una característica en común que es su fórmula química. Es decir son isómeros.
Para determinar que existe un cambio es necesario cuantificar la lectura de un tubo control que contiene solo a la enzima sin sustrato para que a partir de allí pueda notarse una reacción ocambio.
El objetivo de esta práctica es demostrar la especificidad enzimática de la enzima de glucosa oxidasa sobre la glucosa. Y de acuerdo a la lectura de absorbancia de cada sistema en el colorímetro demuestra que si existe una mayor concentración en el tubo n° 2 debido a que la glucosa oxidasa se encuentra con su sustrato específico (glucosa).
Mientras que en el tubo n°3 hay una menorconcentración ya que se trata del isómeros de la glucosa (fructosa) y esta enzima (GOP) confunde a su sustrato específico con un sustrato similar, no llegando a unirse completamente y arrojando por si una lectura baja.

8. CONCLUSION.

La glucosa oxidasa (GOP) es la enzima específica para la glucosa.
La glucosa oxidasa (GOP) confunde a su sustrato específico (glucosa) con un isómero llamado fructosa.La medida de absorbancia demuestra que la glucosa oxidasa reacciona mejor con la glucosa que con la fructosa.

9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

Dra. Coto E., Curso de Introducción al conocimiento científico experimental. Revista Electrónica del Depto. de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. [Online] Recuperada el 04 de abril del 2013 de:...