Enzimas Utilizadas En El Análisis Del Adn Y Biologia Molecular

ENZIMAS UTILIZADAS EN EL ANÁLISIS DEL ADN Y BIOLOGIA MOLECULAR

I.ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
1. Introducción:
Un fenómeno observado en el laboratorio consiste en que un virus de bacteria (un fago) capaz de propagarse en una cepa bacteriana determinada se replica en forma ineficiente cuando es cultivado en una cepa diferente. Se dice que estos fagos están restringidos cuando se encuentran en unacepa bacteriana diferente de aquella en la cual han sido propagados originalmente. Sin embargo, casi siempre una pequeña proporción del fago es capaz de evadir el estado de restricción y crecer de manera adecuada en la nueva cepa bacteriana, a pesar de que la progenie de este fago será incapaz de crecer en la cepa bacteriana que originalmente permitió la propagación del fago precursor. Estasobservaciones sugieren que una modificación específica inducida por la nueva bacteria hospedera protege al fago de manera que no puede ser restringido dentro de la nueva cepa bacteriana, pero a la vez pierde la capacidad para crecer en la antigua cepa hospedera.
A principios de los años sesenta, Bertani, Weigle y Arber demostraron en forma independiente que la modificación inducida por el hospederoocurre en el nivel del ADN del fago, y el fenómeno de restricción es consecuencia de la degradación por hidrólisis enzimática del ADN viral que no ha sido modificado. El ADN de la bacteria hospedera y otros ADNs presentes en dicha célula son modificados por la adición de grupos metilo (CH3) en sitios específicos, los cuales son normalmente reconocidos por un tipo de enzimas conocidas como enzimasde restricción, las cuales solamente pueden degradar ADN no metilado. Así, la metilación de una base en particular presente en la secuencia de nucleótidos reconocida por la enzima, impide la hidrólisis y ruptura del ADN en la región de ésta secuencia.
El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue concedido a los microbiólogos Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de lasendonucleasas de restricción lo que condujo al desarrollo de la tecnología de ADN recombinante. El primer uso práctico de su trabajo fue la manipulación de la bacteria E. coli para producir insulina humana para los diabéticos.

2. Definición
Las enzimas de restricción son endonucleasas que reconocen una secuencia de entre 4-8pares de bases en una molécula de ADN de doble hebra. El sitio dereconocimiento se llama sitio de restricción y la enzima rompe un enlace fosfodiéster en la hebra guía y otro enlace fosfodiéster en la hebra complementaria.
 Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguirentre el DNA extraño y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacteriano.
Las enzimas de restricción que a pesar de ser distintas y provenir de distintas especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas Isoesquizómeros.Por ejemplo, están los isoesquizómeros Asp718 y KpnI.

3. Tipos de enzimas de restricción

Tipo I

Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restricción (corta) y modificación (metila). Al reconocer la secuencia específica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea aguas arriba o aguas abajo. El corte deja extremos cohesivos. Necesitan de ATP paramoverse en el DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases aproximadamente), además de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg++ como cofactores.
Tipo II
Solo tienen actividad de restricción. Otras enzimas llevan a cabo la metilación. El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de él, por lo que el corte es resistente y predecible. Por...