Enzimas y Fosfatasa Acida

Pontificia Universidad Católica de Chile
Facultad de Química
Departamento de Química-Física


Propuesta N°3

ENZIMAS, FOSFATASA ÁCIDA

Integrantes: Francisco Flores M – David Lillo P.

* Objetivos general:
-Caracterizar la cinética enzimática de la fosfatasa ácida

* Objetivos específicos:
-Determinar el efecto del pH en lareacción de la fosfatasa ácida
-determinar el efecto de la temperatura en la reacción enzimática
-Estudiar el efecto de la concentración del sustrato en la reacción de la enzima
x-determinar el efecto de un inhibidor en la cinética de la reacción

* Fundamento:

Las fosfatasas ácidas se encuentran en la mayoría de los tejidos del cuerpo humano, siendo su mayoría en la próstata,estómago, hígado, músculo bazo , eritrocitos y plaquetas.
Estas enzimas catalizan la hidrólisis de los grupos esteres presentes en el ácido ortofosforico (derivado de los azúcares fosforilados, como el ADN, el ARN y la adenosina trifosfato (ATP)). A continuación se esquematiza su acción a través de una reacción:

Existen dos tipos de esta enzima, y la clasificación radica en el pH que las haceactivas. La primera es la fosfatasa alcalina que trabaja a pH de 8 a 10 y la fosfatasa ácida, la cual funciona a pH entre 4 y 6. Ya que son proteínas con acción enzimática, ambas se pueden medir en la presencia de sustratos tales como: fenilfosfato, glicerofosfato, p-nitrofenilfosfato o mofosfato de timolftaleína. Siendos estos dos últimos compuestos cromógenos. En este caso, la cantidad detimolftaleína liberada por la hidrólisis de la fosfatasa se puede estimar por métodos colorimétricos siempre cuando se encuentre en un medio alcalino (presencia de NaOH en el procedimiento).

La actividad de la fosfatasa ácida puede diferenciarse mediante el uso de inhibidores en la mezcla usada para en ensayo, el formaldehido no ejerce efecto sobre la enzima de origen prostático, pero si en lasfosfatasas presentes en los otros tejidos, mientras que el tartrato es un inhibidor selectivo de la enzima prostática.
Para llevar a cabo cualquier tipo de reacción enzimática se debe conocer si es que la enzima actúa con cofactor o coenzima, papel fundamental en la regulación de la acción enzimática, para el caso de la fosfatasa ácida la presencia de Mg2+ en la mezcla es fundamental paracumplir este rol.


Se utiliza un tampón para poder detener la formación de producto debido a que este frena la actividad de la enzima, debido a que se necesita calcular la formación de producto en un tiempo determinado

* Procedimiento

Reactivos y materiales
100 g hígado de ave
20 mL Buffer citrato 0.10M (de pH 3.0; 4.0: 4.8; 5.2;5.7; 6.2; 7.0; 8.0.)
20 mL α-Naftilfosfato 1mmol/L (pH = 5.3)
20 mL Citrato de sodio 0,03M
10 mL NaOH 0.1M.
20 mL MgCl2 25mM.
10 mL NaH2PO4 0,02 M (en buffer citrato pH = 5.6)
Agua destilada
Hielo
Homogeneizador
Tubos de ensayo
Pipetas
Probetas
Vaso precipitado
Termómetro
pHímetro

A) Preparación del extracto de crudo de la enzima

El crudo se prepara a partir de hígado deave. Se debe mantener precaución en controlar una baja temperatura de trabajo, por lo cual siempre mantener el hígado y los extractos en hielo. Se debe limpiar el hígado de todo residuo de grasa. Luego, se corta en trozos pequeños, que se van dejando en frió. Los trozos se sitúan en un homogeneizador con agua destilada entre 0°C y 4°C. En el caso de repetir el proceso, se debe resguardar elcontrol de temperatura. Se filtra el homogenizado conservando este último en un vaso precipitado a baja temperatura.

B) Efecto del pH en la reacción enzimática

Para determina el efecto del pH sobre la reacción enzimática de la fosfatasa ácida se realizan reacciones en buffer citrato a distintos valores de pH según lo indicado a continuación

Tubo | B | C | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |...