Enzimas

TEMA 3: Métodos para el análisis de proteínas 3.1. Cuantificación de proteínas totales. 3.2. Técnicas de separación de proteínas. Análisis de proteínas específicas. INTRODUCCIÓN A lo largo de este tema vamos a estudiar las distintas técnicas que nos permiten analizar desde un punto de vista cuali y cuantitativo, el contenido proteico de las muestras biológicas haciendo especial hincapié en elestudio de las proteínas plasmáticas. Las proteínas están presentes en todas las células y en los distintos líquidos corporales: suero o plasma (66-83g/L), orina (100-200 mg/L), líquido cefalorraquídeo (15-45 mg/dL). Si nos centramos en las proteínas plasmáticas, podemos diferenciar: • Proteínas plasma-específicas: componentes habituales del plasma. • Proteínas no plasma-específicas: aquellas queaparecen en el plasma por rotura de otras células. Las proteínas plasma-específicas (albúmina + globulinas) se sintetizan fundamentalmente en el hígado, pero también en: células plasmáticas, ganglios linfáticos, bazo y médula ósea. En caso de enfermedad, tanto la concentración total como la de las distintas fracciones pueden verse alteradas. Así, la determinación de las proteínas totales sirve parael diagnóstico de: • Afecciones hepáticas • Afecciones de la médula ósea • Otras afecciones del metabolismo o nutricionales 3.1. Cuantificación de proteínas totales Los principales métodos empleados para la determinación de proteínas totales son los siguientes: • Método del Biuret En solución alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptídico de las proteínas dando un color purpúreo que secuantifica espectrofotométricamente (540nm). Como estándar se utiliza una solución de albúmina. Proteína + Cu+2 Complejo Cu-Proteína (púrpura)

Muestra: suero o plasma (heparina o EDTA). Separar el suero del coágulo o el plasma de las células antes de 3h. Si el paciente está acostado durante la extracción el resultado será menor. • Método de Lowry Dependen de la concentración de tirosina y triptófano dela muestra. Consiste en dos reacciones: 1. Reacción de Biuret

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2. Reacción de Folin: característica de los grupos –OH reductores de los aminoácidos tirosina y triptófano que, junto con los complejos Cu+2 , reducen el reactivo de Folin generando un color azul. Está sujeto a muchas interferencias. Se utiliza fundamentalmente en orina. • Turbidimetría Medición de la turbidez resultante de laprecipitación de proteínas • Absorción en el ultravioleta Se mide la absorbancia a 270nm originada fundamentalmente por los anillos aromáticos de triptófano y tirosina. • Métodos de unión a colorantes NOTA: para semicuantificar la concentración de proteínas en orina se utilizan tiras reactivas. 3.2. Técnicas de separación y análisis de las proteínas La proporción de las fracciones proteicasindividuales cambia en el transcurso de un gran número de enfermedades lo que conlleva que, la cuantificación de las mismas sea de valor considerable en el diagnóstico clínico. Los procedimientos más utilizados actualmente en el laboratorio clínico para el estudio de las proteínas son los siguientes: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Turbidimetría y nefelometría Inmunodifusión Electroforesis InmunoelectroforesisInmunoelectroforesis en cohete Inmunofijación Cromatografía

1.- TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión parte de la luz se dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe. La dispersión de la luz depende de: la longitud de onda de la luz (?), del tamaño de la partícula y del índice de refracción de la partícula en relación con elmedio que la rodea. La dispersión de la luz se puede medir por turbidimetría o por nefelometría. En ambas técnicas, para dar como resultado una concentración de proteína concreta, se compara la cantidad de luz dispersada o la tasa de aumento de dispersión con los valores de dichos parámetros en estándares proteicos conocidos.

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1.1.

La turbidimetría mide la disminución de la luz...