Enzimas

Conceptos y Técnicas de Biotecnología I

PRODUCCION DE AMILASAS FUNGICAS

OBJETIVO
El trabajo práctico consiste en el aislamiento de hongos productores de enzimas hidrolíticas del almidón, producción de estas enzimas, medición de su actividad enzimática en forma soluble e inmovilizada y su utilización para la producción de etanol.

INTRODUCCION
Las enzimas que hidrolizan el almidónson un conjunto de enzimas ((-amilasa, (-amilasa, glucoamilasa y enzimas desramificadoras) hidrolíticas que catalizan la degradación del almidón. Cada enzima tiene una actividad característica generando distintos productos como se observa en la siguiente figura. Existen amilasas de uso industrial tanto de origen bacteriano como fúngico.

Las amilasas son producidas a gran escala para su uso enla industria de la alimentación y de la producción de combustibles. Los usos más importantes son:
1. Hidrólisis parcial del almidón para generar dextrinas que son utilizadas como espesantes.
2. Obtención de jarabe de alta maltosa (Glu-Glu) utilizados en la fabricación de la cerveza y confituras (dulces, helados, tortas).
3. Obtención de jarabes de alta glucosa utilizados en la fabricación decerveza, panes y repostería, confituras y bebidas no alcohólicas.
4. Remoción del almidón utilizado como apresto en la industria textil.
5. Hidrólisis parcial del almidón en la industria panadera para la liberación de glucosa que es sustrato de fermentación de las levaduras para producir el leudamiento de la masa.
6. Hidrólisis del almidón para ser utilizado como fuente de carbono en diversasfermentaciones, entre ellas la producción de etanol para uso alimenticio y combustible.

DISEÑO EXPERIMENTAL

Parte I: AISLAMIENTO Y SCREENING

Día 1: Aislamiento (1ª parte)
Se colocan semillas de lenteja sobre un medio Sólido de agar YPD conteniendo 5 % NaCl (para evitar el desarrollo de especies Mucorales) y 0.01 % tetraciclina (antibiótico que inhibe el crecimiento bacteriano). Se colocan 4semillas por caja de Petri. Se incuba a 28°C durante 7 días.

Día 2: Aislamiento (2ª parte)
Las colonias de hongos (preferentemente las verdes sobre las negras o blancas) se repican con un escarbadiente en cajas de Petri con agar YPD. Se incuba a 28°C durante 7 días.

Día 3: Screening de cepas productoras de amilasas (1ª parte)
Las colonias aisladas se pican en cajas de Petri con mediosólido de almidón 1 % y agar 1.5 %. Se incuba a 28°C durante 4 días.

Día 4: Screening de cepas productoras de amilasas (2ª parte)
Las cepas productoras de enzimas hidrolíticas del almidón se detectan observando el halo de degradación del almidón (círculo claro alrededor de la colonia). Para facilitar la detección, se revela la presencia de almidón en el medio por el agregado de solución deI2/KI (0.026 % I2 + 0.26 % KI) que se acompleja con el polisacárido dando una coloración azul.

Parte II: PRODUCCION DE AMILASAS

Día 4: Producción de esporas
Las colonias con actividad amilásica se repican en tubos en pico de flauta conteniendo medio de 5 % salvado triturado y agar 2 %. Se estría con ansa cada colonia en un pico de flauta. Se incuba a 28°C durante 5 días.

Día 5: Producciónde enzimas por fermentación en sustrato sólido
Las esporas de cada pico de flauta se resuspenden en 5 ml de solución acuosa de Sarkosyl 0.05 %. Se inocula 1 ml de la suspensión de esporas en erlenmeyers de 250 ml conteniendo 5 g de salvado y 5 ml de agua destilada. Se incuba a 28°C durante 5 días.

Día 6: Extracción de las enzimas
La enzimas extracelulares producidas en la fermentación delsalvado por el hongo se extraen con 50 ml de NaCl 1.0 %. Agitar durante 30 min a temperatura ambiente. Filtrar por papel de filtro y conservar el eluido.

Parte III: MEDICION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Día 6: Medición de la actividad enzimática
La actividad amilásica se determinará utilizando almidón como sustrato. Se cuantificará la desaparición del sustrato por espectrofotometría.
La...