Enzimas

Parte Experimental
Para determinar la actividad enzimática de la β –galactosidasa es necesario confeccionar una curva de calibración con una concentración conocida de sustrato patrón o-nitrofenol.Para confeccionar la tabla se dispuso de los siguientes compuestos:
* o-nitrofenol (ONF) 0,5[mM]
* Amortiguador fosfato de Sodio pH 7,2 0,1M
* Carbonato de Sodio1,0M
* Agua destilada
A continuación se muestra el protocolo para la curva de calibración, el cual va desde 0,02 a 0,3[µmoles/mL] de ONF. Luego a cada tubo se le midió su absorbancia,resultados que se detallan más adelante.
Tabla I: Protocolo para la confección de la Curva de calibración
Tubo | ONF [mL] | ONF [µmoles] | Amortiguador [mL] | Agua [mL] | Carbonato de Sodio [mL] |Volumen Total [mL] |
1 | 0 | 0 | 0,5 | 2,2 | 0,3 | 3,0 |
2 | 0,3 | 0,05 | 0,5 | 1,9 | 0,3 | 3,0 |
3 | 0,6 | 0,1 | 0,5 | 1,6 | 0,3 | 3,0 |
4 | 1,2 | 0,2 | 0,5 | 1,0 | 0,3 | 3,0 |
5 | 1,5 |0,25 | 0,5 | 0,7 | 0,3 | 3,0 |
6 | 1,8 | 0,3 | 0,5 | 0,4 | 0,3 | 3,0 |

Luego se definió 1,5[mL] como volumen de incubación y además se realizaron dos controles, blanco enzima y blanco sustratopara medir la actividad enzimática.
Se determinó el inicio de la incubación al instante que se agregó la enzima a los tubos de la reacción y del blanco sustrato. Para el tubo correspondiente al blancoenzima el inicio de incubación se consideró al momento de agregar el sustrato. Cabe destacar que para este procedimiento se utilizó un sustrato artificial (o-nitrofenil- β –galactósido, ONFG [0,01M])dado que al entrar en contacto con la enzima se torna de un color amarillo, lo que hace más evidente y más fácil de detectar la actividad de la enzima.
Los tres tubos fueron incubados por 9 minutos auna temperatura ambiente de 30°C, y luego se midió la absorbancia de cada uno de ellos. En la tabla a continuación se detalla la preparación del tubo de incubación y los dos controles.
Tabla II:...