enzimas

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Practicas de PROCESOS bioquimicOS Y METABOLICOS

7. PRÁCTICA. PRUEBAS DE FUNCIONALIDAD HEPATICA
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD FOSFATASA ALCALINA EN SUERO

ESQUEMA
- Introducción
- Fundamento teórico
Unidades de medida de la actividad enzimática
Pruebas de funcionalidad hepática
Tabla resumen de las enzimas relacionadas con las pruebas defuncionalidad hepática
Determinación cinética de la actividad fosfatasa alcalina en suero
- Procedimiento práctico: Materiales y reactivos
Procedimiento experimental y resultados
- Análisis y discusión de los resultados obtenidos, comentarios y conclusiones

I. INTRODUCCIÓN
En esta práctica se va a realizar la determinación cinética de la actividad de la fosfatasa alcalina
(FAL) enplasma sanguíneo. Para ello se va a emplear el método colorimétrico del p-nitrofenilfosfato, determinando el incremento de absorbancia en función del tiempo de incubación.
Asimismo se estudiarán otras determinaciones enzimáticas que se utilizan como pruebas de
funcionalidad hepática. Finalmente se discutirá la importancia de dichas determinaciones en la
Bioquímica Clínica, su relación con laactividad de ciertos órganos (ej. hígado, músculo cardiaco
y tejido óseo), así como su valor diagnóstico y/ó pronóstico en ciertas patologías.

Verónica González Núñez

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II. FUNDAMENTO TEORICO
IIa. Unidades de medida de la actividad enzimática
Unidad enzimática (U): cantidad de enzima que cataliza la transformación de un μmol de
sustrato por minuto a 25 C y en condiciones óptimas detrabajo para la enzima. Dimensiones:
μmol min-1.
Katal (Kat): unidad del SI. Actividad catalítica que permite aumentar la velocidad de una reacción
en un factor de un mol por segundo. Dimensiones: mol s-1.
Relación entre ambas unidades:

1Kat =

1 min
1mol
1μmol 1μmol
1mol
; 1U =
;
;
*
* 6
1 min 1 min 10 μmol 60s
1s

1U = 16.67 nKat
1μKat = 60U

En ciertos casos, las unidadesde actividad enzimática no se refieren a cantidad de sustancia,
sino a concentración. Así, también se habla de U/L ó de Kat/L.
Otros conceptos importantes.
- Actividad total: número total de unidades de enzima que existen en una muestra.
- Actividad específica: número total de unidades de enzima por mg de proteína. Determina el
grado de pureza ó el factor de purificación de una enzima en unextracto.

IIb. Pruebas de funcionalidad hepática
Alanina aminotransferasa (ALAT/GPT)
L-alanina:2-oxoglutarato aminotransferasa (EC 2.6.1.2)
Esta enzima se localiza principalmente en el hígado, pero también en riñones, corazón y
músculo (aunque en menores cantidades). Sus niveles en sangre aumentan por lesión
hepatocelular que cursa con muerte celular e inflamación.
Los niveles de ALATaumentan
- x10 en hepatitis agudas (ya sean de origen vírico ó tóxico) y se mantienen elevados durante
3 – 6 meses.

Verónica González Núñez

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- x4 (como máximo) en hepatitis crónicas y se mantienen elevados durante 1 - 2 meses.
- generalmente, los niveles de ALAT > ASAT en hepatitis.
Los niveles de ALAT no tienen por qué estar aumentados en otro tipo de patologías hepáticas,
talescomo la colestasis biliar, cirrosis ó algunos tipos de cáncer hepático. Por ello, los niveles de
ALAT se solicitan para determinar el tipo de lesión hepática y su posible evolución.
La determinación de ALAT se basa en el acoplamiento de la reacción de transferencia del grupo
amino que cataliza la propia enzima con una reacción que consume NADH.
(1)

ASAT
Ala + α − KG ⎯⎯ → Pir + Glu
⎯(2)

Pir + NADH ⎯LDH → lactato + NAD +
⎯
⎯

La extinción de la absorbancia del NADH en función del tiempo se puede determinar midiendo la
disminución de la absorbancia a λ = 340 nm durante varios intervalos de tiempo. Como esta
longitud de onda no se encuentra en el espectro visible, es necesario utilizar un
espectrofotómetro con lámpara de Hg.

Aspartato aminotransferasa (ASAT/GOT)...