enzimas

UNIVERSIDAD DE TALCA
Instituto de Biología Vegetal y Biotecnología
Estructura y Fisiología Celular I

Taller de Cinética Enzimática

Para la determinación de la actividad enzimática se utilizará como modelo de trabajo la enzima
fosfatasa, que cataliza la hidrólisis de monoésteres de fosfato con la consecuente liberación de fosfato
inorgánico.

O−
|
R−O−P=O
|
O−

Fosfatasa
+ H2OR − OH + Pi

Las fosfatasas son enzimas ampliamente distribuidas en la naturaleza.
Son generalmente clasificadas en relación a su pH óptimo de actividad, en fosfatasas ácidas y fosfatasas
alcalinas. Las semillas vegetales son particularmente ricas en fosfatasas ácidas. La actividad de las fosfatasas
ácidas aumenta bruscamente durante la germinación de las semillas y luego decae a medida quese desarrolla
la plántula. La función fisiológica de este tipo de fosfatasas no se conoce con certeza, pero parece estar
relacionada con la liberación de fosfato desde diversas formas de almacenamiento, para su posterior
utilización metabólica durante la germinación.
Las fosfatasas también son enzimas importantes en el hombre. Se encuentran niveles significativos de
fosfatasa ácida en elbazo, los eritrocitos, las plaquetas y la glándula prostática. Por tanto, el aumento de la
fracción prostática de la fosfatasa ácida se produce como resultado del carcinoma de próstata y el trauma
operatorio. El aumento de la fosfatasa ácida total se produce en varias enfermedades hepáticas y óseas, en la
enfermedad de Gaucher y la excesiva destrucción de plaquetas. Por su parte, la fosfatasaalcalina está alterada
en enfermedades óseas (cáncer al hueso, osteomalasea), raquitismo, hiperparatidoidismo, obstrucción de
conductos biliares, embarazo y padecimiento hepático producto de la administración de ciertas drogas.
Además, la fosfatasa alcalina está disminuida en hipertiroidismo y en el retardo de crecimiento en los niños.
Existen dos tipos de ensayos enzimáticos:
a) Ensayo de tiempofijo: en este ensayo se detiene la reacción después de un tiempo determinado y
se mide la concentración de producto formado o de sustrato consumido. Es el más sencillo y el
más utilizado.
b) Ensayo cinético: en este caso se determina la concentración de sustrato o de producto en forma
continua durante el transcurso del ensayo, o a una serie de tiempos muy próximos.

En el presentepráctico, se estudiará en la cinética de la reacción catalizada por la fosfatasa ácida,
usando un ensayo de tiempo fijo. Se estudiarán ciertas propiedades cinéticas de la enzima, tales como: efecto
de la temperatura, constante de Michaelis-Menten (KM) por el sustrato y cinética de inhibición por fosfato.
Ensayo de actividad de fosfatasas ácidas
Para la determinación de la actividad enzimática seaprovechará la amplia especificidad de sustrato
que posee la enzima fosfatasa ácida. Se utilizará para ello el sustrato artificial p-nitrofenilfosfato (pNPP), el
cual al ser hidrolizado por la acción de la enzima se transforma en fosfato inorgánico y p-nitrofenol.
En medio alcalino el p-nitrofenol formado se encuentra en la forma de p-nitrofenolato, el cual es un
compuesto coloreado que presentamáximos de absorción en la región de los 405 nm. Esta propiedad
permitirá la cuantificación del producto de la reacción mediante el uso de un espectrofotómetro.
Como inhibidor especifico de la reacción se utilizara el fosfato de sodio, una molécula ionizable que
en solución se separa en ión fosfato e ión sodio.
Pi
Fosfatasa ácida
p-nitrofenilfosfato

p-nitrofenolato

+

fosfato inorgánicoMetodología
Con los datos mostrados en la tabla 1, construir una curva de calibración y con los datos entregados en
clase determinar de manera gráfica y matemática la constante de Michaelis, la velocidad máxima, el
Km, el tipo de inhibición y la constante de inhibición para los elementos propuestos.
Con los datos de la tabla siguiente y a partir del stock de p-nitrofenilfosfato 25 mM,...