Enzimas

Practica No. 1 Curva tipo Introducción. Una curva tipo es la representación gráfica mediante la cual se puede transformar la absorbancia obtenida experimentalmente en concentración (g, mg, µg). Una curva tipo se construye con muestras de concentración conocida, las cuales deben ser corridas por duplicado o triplicado. Durante el desarrollo de esta práctica se construirán dos curvas tipo paradeterminar la concentración de proteína y de tirosina en una muestra dada. Objetivo Elaborar curvas tipo para determinar la concentración de proteína en un extracto crudo enzimático, y cuantificar la liberación de productos en una reacción enzimática. Material Tubos de ensayo Pipetas de 1, 5 y 10 mL Gradillas Celdas Vasos de precipitados Espectrofotómetro Cronómetro Incubadora a 37°C VortexSoluciones y Reactivos Solución Patrón de albúmina sérica bovina en agua destilada (1mg/mL). Solución Patrón de tirosina en agua destilada (0.1mg/mL). Reactivo A (Anexo 2). Reactivo B (Anexo 2). Reactivo C (Anexo 3). Reactivo D (Anexo 3).

Reactivo E (Anexo 3). Procedimiento Curva tipo de Tirosina. Lowry modificado (Saheky y Holzer, 1975) 1. Organizar una serie de tubos de acuerdo a la siguientetabla. Tubo µg de tirosina µL de solución patrón de tirosina (0.1mg/mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 0 0.5 1 2 4 8 16 20 0 5 10 20 40 80 160 200 200 195 190 180 160 120 40 0 µL de agua destilada

2. Realizar lo anterior por triplicado. 3. Agregar 0.2 mL del reactivo A, agitar vigorosamente en el Vortex e incubar 10 min a temperatura ambiente. 4. Agregar 1 mL del reactivo B, agitar vigorosamente en el Vortex eincubar 30 min a 37°C en obscuridad. 5. Leer en espectrofotómetro a 660 nm calibrando con el tubo 1. Curva tipo de Proteína. (Lowry, 1951) 1. Organizar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla. Tubo µg de Albúmina µL de solución patrón de Albúmina (1mg/mL) 1 2 0 0.5 0 5 200 195 µL de agua destilada

3 4 5 6 7 8

1 2 4 8 16 20

10 20 30 40 50 60

190 180 170 160 150 140

2.Realizar lo anterior por triplicado. 3. Agregar 1 mL del reactivo C + D en una relación 1:100, agitar vigorosamente en el Vortex e incubar 15 min a temperatura ambiente. 4. Agregar 0.1 mL del reactivo E, agitar vigorosamente en el Vortex e incubar 30 min a 37°C en obscuridad. 5. Leer en espectrofotómetro a 660 nm calibrando con el tubo 1. Análisis de resultados Con los datos obtenidos calcular la mediay la desviación estándar en cada experimento realizado, así como el coeficiente de correlación de los datos. Elaborar las curvas patrón graficando Absorbancia contra concertación. Determinar la ecuación de la recta para cada curva. Discutir los resultados. Bibliografía. 1.- Bollag, D. M., Edelstein S.J. (1991). Protein Methods. 4ª edición. USA: Wiley-Liss, Inc. 56-59 p. 2.- Lowry, O. H., N. J.Rosebrough, A. L. Farr y R. J. Randall. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275. 3.- Saheki, T., Holzer, H. (1975). Proteolytic activities in yeast. Biochem Biophys Acta 348: 203–214.

Practica No. 2 Determinación de la actividad de una enzima Introducción. Un catalizador es una sustancia que incrementa la velocidad de una reacción química. La mayorparte de los catalizadores biológicos son proteínas y se les denomina enzimas, las cuales realizan reacciones biológicas con una eficiencia extraordinaria, siendo mediadoras del metabolismo y encargadas prácticamente de toda reacción que transcurre en la célula. Las enzimas se diferencian de los catalizadores químicos en varios aspectos importantes; 1. Poseen velocidades de reacción más elevadas,2. Reaccionan en condiciones más suaves, 3. Poseen alta especificidad con respecto al sustrato y 4. Poseen la capacidad de regulación. La sustancia sobre la cual actúa una enzima se denomina sustrato. Algunas enzimas actúan sobre un grupo de sustratos relacionados y otras sobre un simple compuesto. El sitio activo de la enzima es la región que se une al sustrato posee residuos que participan...