enzimiologia

QUÍMICA BIOLÓGICA I
Trabajo Práctico Nº 3
CINÉTICA ENZIMÁTICA I

Las enzimas son los catalizadores de las reacciones químicas de los seres vivos. El estudio de la actividad de una enzima como catalizador en una reacción es abordado por la Cinética Enzimática.
La CINETICA ENZIMATICA es el estudio de la velocidad de las reacciones químicas catalizadas por enzimas, y de cómo diferentesparámetros experimentales pueden modificarla.
Actualmente, los estudios clásicos de la actividad enzimática son complementados con estudios de la estructura tridimensional de la proteína, que pueden predecir algunos aspectos del mecanismo de unión entre enzima y sustrato. En tanto que los estudios de mutagénesis dirigida nos permiten conocer la importancia de determinados residuos de aminoácidos en laactividad enzimática. La integración de estos conocimientos nos permitirá conocer el rol de una determinada enzima en un proceso biológico.
La actividad de una enzima determinará la velocidad de una reacción catalizada por ella. En la Práctica se determina midiendo la cantidad de Producto formado o Sustrato consumido en la unidad de tiempo.
Si se analiza una reacción enzimática en función deltiempo, en un primer momento la formación de producto aumenta en forma directamente proporcional al tiempo de incubación, pero pasado un cierto tiempo se nota una disminución de la formación de producto por unidad de tiempo. Las principales causas de esta disminución son:
1. Disminución en la concentración de sustrato.
2. Inhibición de la enzima por los productos de la reacción o por un cambioen las condiciones del medio.
3. Inactivación de la enzima por la temperatura o pH de la reacción
4. Acumulación de producto que tiende a establecer el equilibrio de la reacción.
Estas son las razones porque no debemos trabajar en otras condiciones que no sean Vo
Cuando se grafica el producto formado en función del tiempo de incubación, la pendiente de la curva donde el producto aumenta enforma directamente proporcional al tiempo se considera velocidad inicial (Vo).

Como se ve, en la zona donde la formación de producto es directamente propor-cional al tiempo (Figura 1A), la velocidad es constante (Figura 1B) y es la mayor velocidad que se puede conseguir en esas condiciones (Vo); a tiempos supe-riores la velocidad comienza a disminuir.



La metodología general a seguir paradeterminar la velocidad inicial (Vo) es:
Incubar una determinada cantidad de enzima fija, con una concentración adecuada de sustrato, en condiciones constantes de pH y temperatura.
Medir la cantidad de producto formado en distintos tiempos.
Con los datos obtenidos, graficar producto en función del tiempo (Figura 1A).
Dividir el valor del producto obtenido por el tiempo de incubaciónempleado y así se obtendrá la velocidad (cantidad de producto/unidad de tiempo).
Graficar velocidad en función del tiempo. En esta gráfica se visualizará claramente el rango de Vo (Figura 1B).
“En cualquier reacción enzimática siempre se debe trabajar en condiciones de Vo”

La actividad de una enzima se puede expresar en términos de unidades de enzima o unidades internacionales (UI). La UI(recomendada por la Unión Internacional de Bioquímica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversión de un micromol de sustrato en un minuto (µmol/min). La actividad específica es el número de unidades internacionales de enzima por miligramo de proteína (UI/mg de proteína).
Asimismo es útil definir una constante de velocidad general, kcat, para describir la velocidad limitantede cualquier reacción enzimática a saturación si se conoce la concentración de enzima usada en el ensayo [Et]. En una reacción michaeliana kcat= Vmáx/[Et]. La kcat, denominada también número de recambio, es una constante de velocidad de primer orden con unidades de tiempos inversos y es equivalente al número de moléculas de sustrato convertidas en producto en una unidad de tiempo, por una sola...