Enzimologia

ENZIMOLOGIA I



Introducción

La mayoría de las enzimas son proteínas, y su función consiste en catalizar reacciones biológicas. Esta actividad catalítica dependerá de la integridad de su conformación nativa (Nelson y cols.). Si se desnaturaliza o disocia una enzima descomponiéndola en sus aminoácidos constituyentes, siempre se perderáesta capacidad, por esta razón las estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria son determinantes en su función catalizadora.
Dentro de los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se pueden distinguir los de tipo físicos (temperatura) y químicos (detergentes, disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica). Por ejemplo, el β- mercaptoetanol es un compuesto utilizado enlaboratorio para reducir los enlaces disulfuro. Además puede actuar como antioxidante biológico reciclando radicales hidroxilo. La presencia de este grupo le confiere solubilidad en agua. El SDS (dodecil sulfato de sodio) es un detergente aniónico que funciona como solubilizante de proteínas y de componentes de tejidos y membranas. Actúa incorporando una carga neta negativa, la cual hace que lacarga intrínseca de la proteína sea insignificante, además altera la conformación nativa de esta. Se utiliza en electroforesis para separar proteínas en función de su masa molecular.
Las enzimas funcionan en soluciones acuosas y bajo parámetros estandar por lo general suaves (ph= 7.0 y T= 25°C) acelerando cientos de reacciones biológicas que en ausencia de ellas ocurrirían de forma muy lenta.Durante esta experiencia se utilizo la enzima amilasa salival. Esta se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. El almidón esta formado por dos tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacáridos de glucosa. La amilosa está conformada por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces a- C1-C4, mientras que laamilopectina tiene, además de estos últimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacáridos) como productos.
El objetivo de este laboratorio es analizar el efecto de los factores temperatura y ph sobre la actividad de la enzima amilasa salival. Para ellose utilizara lugol como identificador de la presencia de almidón, de esta manera se determinara el funcionamiento de la enzima a través de la medición colorimétrico.

Metodologia

Para ambas experiencias se utilizo un lavado bucal con una solución de NaCl (30 ml )de un integrante del grupo, el cual fue filtrado con algodón y vertido en un vaso precipitado. Para el analizar el efecto de latemperatura en la enzima se preparo una batería de 5 tubos de ensayo, con las cantidades detalladas a continuación, los cuales fueron incubados por 15 minutos a distintas temperaturas. Posteriormente se procedió a agregar una gota de lugol en cada tubo.

|Tubos |1 |2 |3 |4 |5 |
|NaCl 0.9% p/v|1ml |1ml |1ml |1ml |3ml |
|Tampón fosfato ph 70 |1ml |1ml |1ml |1ml |1ml |
|Almidón 1% p/v |2ml |2ml |2ml |2ml |2ml |
|Preparacion Enzimática |2ml|2ml |2ml |2ml |- |
|Temperatura de incubacion |0ºC |70ºC |25ºC |37ºC |37ºC |

Para la experiencia del efecto del ph se prepararon 4 tubos de ensayo, los cuales contenían tampones de diversos valores. Estos fueron colocados en una gradilla temperatura ambiente...