Enzimologia

PRACTICA Nº 5
EFECTO DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD DE UNA ENZIMA:
OBJETIVOS:
* Establecer la actividad enzimática de una enzima , a través de la elaboración de buffers de distinto pH a partir de un sistema Sal/Acido.
Experimiento1. Elaboración de Buffers de distintos pH
MATERIALES Y MÉTODOS:
Materiales:
* Fosfato monobásico de sodio (H2PO4Na) 0.1 M
* Fosfato dibásico de sodio (HPO4Na2) 0.1M
* NaCl
Procedimiento:
No se ha realizado desviaciones del protocolo propuesto
DATOS Y RESULTADOS:
Cálculos:
Para preparar un Buffer 0.05 M con los siguientes pHs:
Para un pH de 5,6:
pH=pH+logBA
5,6=6,86+logBA = 5,6-6,86=logBA = 0,0549=BA
Si: A + B = 5
Entonces: A = 4,74 ml B = 0,26 mlFuerza iónica:
Fosfato monobásico ((H2PO4-) = 0,0474 M
Fosfato dibásico HPO4- - = 0,0026 M
Na+ = 0,0474 + 0,0052 = 0,0526 M

μ = Σ M Z22
μ= 0,0474 12+ 0,002622+ 0,0526 122
μ= 0,11042 = 0,055

0,143 - 0,055 = 0,088 M
Para una solución de: 0,088 moles → 1000 ml
X → 10 mlX = 0,00088 moles

Para NaCl 5 M: 5 moles → 1000 ml
0,00088 moles → X
X = 0,176 ml
Resultados:

pHs | 5,6 | 6,0 | 6,4 | 6,8 | 7,2 | 7,6 | 8,0 |
ml Acido | 4,74 | 4,39 | 3,71 | 2,67 | 1,57 | 0,77 | 0,34 |ml Base | 0,26 | 0,61 | 1,29 | 2,33 | 3,43 | 4,23 | 4,66 |
μ | 0,055 | 0,062 | 0,076 | 0,097 | 0,119 | 0,133 | 0,143 |
ul NaCl (5M) | 176 | 162 | 134 | 92 | 48 | 20 | --- |

Experimento 2. Determinación del pH de máxima actividad de amilasa salival

MATERIALES Y MÉTODOS:
Materiales:
Materiales de vidrio:
* Beacker de 50 ml
* Tubos de ensayo
* Pipetas de 5 ml y 1 ml
Reactivos y otros:* Muestra de amilasa salival
* Buffer fosfato 0,05 M de sus correspondientes pHs
* Almidón soluble
* Ferricianuro de potasio
Otros:
* Papel aluminio
* Hielo
* Maskintape
* Olla
Equipos
* Baño maría
* Cocinilla

Procedimiento:
No se ha realizado desviaciones del protocolo propuesto
DATOS Y RESULTADOS:
Resultados:
pH | Absorbancia | Absorbancia neta | mg de azuzarreductor |
Blanco | 0.785 | --- | --- |
5.6 | 0.017 | 0.768 | 0.1082 |
6.0 | 0.007 | 0.778 | 0.1068 |
6.4 | 0.006 | 0.779 | 0.1069 |
6.8 | 0.007 | 0.778 | 0.1068 |
7.2 | 0.007 | 0.778 | 0.1068 |
7.6 | 0.006 | 0.779 | 0.1069 |
8.0 | 0.134 | 0.651 | 0.0894 |

Absorbancia neta:
Blanco – Absorbancia = Absorbancia neta
0.785 - 0.017 = 0.768
0.785 - 0.007 = 0.778
0.785 - 0.006 = 0.779
0.785 -0.007 = 0.778
0.785 - 0.007 = 0.778
0.785 - 0.006 = 0.779
0.785 - 0.134 = 0.651

Mg de azúcar reductor:

Absorbancia neta x Factor de calibración: Mg de azúcar reductor
0.768 x 0.1373 = 0.1054
0.778 x 0.1373 = 0.1068
0.779 x 0.1373 = 0.1069
0.778 x 0.1373 = 0.1068
0.778 x 0.1373 = 0.1068
0.779 x 0.1373 = 0.1069
0.651 x 0.1373 = 0.0894

Grafica:

Figura1. Ploteo pH (eje x) vs Absorbancia neta(eje y).
EXPLICACIÓN:
Se forma azúcar reductor en el tubo con: buffer + almidón + enzima, luego de ser llevado a una temperatura determinada (37ºC), al juntar 1 ml de dicho tubo con el ferrocianuro formado por oxidación , el tubo cambiará de color amarillo original a transparente si hay bastante azúcar reductor formado indicando así la actividad que tiene la enzima.

CONCLUSIONES:
* A mayorformación de azúcar reductor en el tubo: ALMIDON + BUFFER + ENZIMA → + REDUCCION del ferricianuro a ferrocianuro → + coloración TRANSPARENTE →
- Absorbancia → + acción de la ENZIMA

Experimento 3. Efecto del pH sobre la estabilidad de amilasa

MATERIALES Y MÉTODOS:
Materiales:
Materiales de vidrio:
* Beacker de 50 ml
* 21 Tubos de ensayo
* Beacker de 500 ml
* Pipetas de 5 ml y 1 ml...