Enzimologia

ENSAYOS ENZIMÁTICOS

EXPRESIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS

Cuando se habla de métodos de ensayo de actividad nos referimos a los métodos de medir la actividad enzimática, lo cual no tiene nada que ver con el método físico usado para detectarla. Los principios generales son básicamente los mismos que veremos más adelante para determinar la concentración de los metabolitos. En principio,toda sustancia que participe en una reacción enzimática puede ser valorada de una u otra manera. Nosotros debemos eliminar las interferencias que puedan producirse a consecuencia de otras sustancias presentes en el medio que puedan dar reacciones similares.
A veces puede aparecer un comportamiento extraño en un ensayo, algo anormal, que puede tener mucha importancia porque puede reflejar algunapropiedad particular de la enzima que se está valorando.
Si se trata de determinar la actividad enzimática es necesario ver en primer lugar qué es la actividad enzimática y cuáles son las unidades. Hay varios tipos de unidades y cada laboratorio, a veces, tiene las suyas propias. Además, existen enzimas como las restrictasas, que tienen sus propias unidades.
La unidad internacional (UI) es unade las más utilizadas. Una unidad internacional es aquella actividad enzimática capaz de transformar 1 μmol de substrato en un minuto. Pero existe también una unidad muy utilizada surgida recientemente que es el katal, que es aquella cantidad de enzima que cataliza un 1 mol de substrato por segundo. Como se refleja en la equivalencia, un extracto con una actividad de un katal es un extracto muyactivo.
1 UI = 1 μmol de S / min
1 kat = 1mol de S /seg
1 kat = 6·107 UI
Pero siempre que se define la unidad hay que definir las condiciones del ensayo, como temperatura, pH, concentración de substrato, etc. por eso siempre hay que añadir “en condiciones óptimas de ensayo”. La temperatura que se debe definir debe ser una temperatura no desnaturalizante, tradicionalmente se usaba 25ººC peroúltimamente se prefiere 30ºC. El pH debe encontrarse en condiciones óptimas porque puede haber mucha diferencia entre la actividad con unos valores que con otros. Las concentraciones de substrato siempre deben ser saturantes.
Si se quiere detectar la actividad enzimática lo primero que hay que tener en cuenta es que el método sea lineal, es decir, si se mantiene un volumen constante y se varía laconcentración de enzima, el producto que se forma a un tiempo determinado debe establecer una línea recta. Sin embargo, no se pueden usar estos datos para extrapolaciones porque no es fiable lo que ocurra a concentraciones de enzima superiores a la máxima, sin embargo, se puede suponer que seguirá siendo lineal. La utilidad de esta propiedad es que si se hacen diferentes ensayos con diferentesmuestras, extractos, sujetos, etc., siempre con la misma cantidad de volumen de muestra, el que tenga más actividad es el que tienen más enzima.
No obstante es bastante habitual encontrar gráficas de tipo 2, suelen ser incluso más frecuentes que las de tipo 1. Pero en todas ellas debe ocurrir que a concentración de enzima 0 no debe haber producto.
Pero para llegar a esta conclusión hay que hacerensayos previos para ver qué ocurre con la producción de producto a lo largo del tiempo. Hay que saber durante cuánto tiempo la velocidad de producción se mantiene constante (pendiente constante, casos 1), cuando lo normal es que la pendiente decline al cabo de transcurrir algo de tiempo (casos 2). Esto se hace porque si se mide un tiempo en que ya no es lineal no se puede usar ese tiempo paraprever la actividad. Hay que usar un tiempo en el que la enzima lleve una linealidad, es decir, esté usando una cinética de primer orden.
La gráfica de tipo 2 suele ocurrir porque:
- Se comienza a agotar el substrato, pero si se acaba el substrato se deja de producir el producto.
- Se alcanza el estado de equilibrio de la reacción.
- El producto actúa como inhibidor y, entonces, a mayor...