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INTRODUCCIÓN:
La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc) y estado de agregación (sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-químicos de la espectrofotometría son relativamentesencillos.
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre ellos el de la fotosíntesis en plantas y bacterias. La Mecánica Cuántica nos dice que la luz está compuesta de fotones cada uno de los cuáles tiene una energía:
Efotón = h×n = h×c/l ,
donde c es la velocidad de la luz, n essu frecuencia, l su longitud de onda y h= 6.6 10 -34
J×s es la constante de Planck. Cuando decimos que una sustancia química absorbe luz de longitud de onda l, esto significa que las moléculas de esa sustancia absorben fotones de esa longitud de onda.
En esta práctica estudiaremos la absorción de luz en el ultravioleta cercano (l»325-420 nm) y en el visible (l»420-900 nm). Cuando una moléculaabsorbe un fotón en este intervalo espectral, se excita pasando un electrón de un orbital del estado fundamental a un orbital excitado de energía superior. De está manera la molécula almacena la energía del fotón:
A + h×n ® A
E(A) = E(A) + Efotón
Como la energía se conserva, la diferencia de energía entre el estado fundamental de la molécula (A) y su estado excitado (A) debe ser exactamente iguala la energía del fotón. Es decir, una molécula sólo puede absorber fotones cuya energía h×n sea igual a la energía de un estado molecular excitado. Cada molécula tiene una serie de estados




2. OBJETIVOS:

1. Explica las bases teóricas del uso y funcionamiento de un espectrofotómetro.


2. Manipula y opera correctamente el espectrofotómetro.


3. Aplica la técnica de la fotometríaen la medición de la concentración desconocida de un colorante a través de una curva de calibración previamente construida.

4. Conocer y aplicar los fundamentos de la ESPECTROFOTOMETRÍA.


5. Seleccionar la longitud de onda apropiada para DETERMINACIÓN de absorbancia.



3. MATERIALES:
Pipetas volumétricas 2ml
Micropipetas 100 – 1000 ul/ 10 – 100 ul
Azul de metileno (comercial) 0.1mg/ml
Agua destilada
Gradillas de metal
Tubos de ensayo
Pipetas de 1,2 y 5 ml
Espectrofotómetro Spectronic 20
Cubetas de polipropileno.





PREPARACIÓN DEL EQUIPO:
1. Encienda el SPECTRONIC 20 haciendo girar el interruptor de encendido (botón situado en el lado izquierdo del aparato) botón (a) en sentido de las manecillas del reloj.
2. Permita que el espectrofotómetro se caliente almenos 15 minutos antes de utilizarse con el ojbeto de estabilizar la fuente y el detector, se activará la luz roja de encendido (b).
3. Después del periodo de calentamiento, seleccione la longitud de onda deseada co el botón de control de longitudes de onda, botón (c).
4. Ajuste la escala del instrumento a 0% de T con el control de cero (a) en el lado izquierdo del aparato.
5. Asegúrese que elcompartimiento de muestra esté vacío y cerrado (d).
6. Llene una celda limpia con agua (u otra solución blanco, en este caso HCL 1%) y limpiela con una toallita para quitar las gotas, polvo e impresiones de la muestra.
7. Coloque la muestra en el compartimiento de muestra (d) y haga coincidir la guía marcada en la celda con la guía marcada en el compartimiento de muestra y cierre la tapa.
8.Presione firmemente la celda en el compartimiento de muestra y cierre la tapa.
9. Ajuste la escala del instrumento a 100% T con el control de Transmitancial/ Absorbancia (botón (e) del lado derecho del instrumento).
10. Retire la celda del compartimiento y deseche su contenido.
11. Enjuague 2 veces la celda con pequeños volúmenes de la solución a ser medida y luego llénela con dicha solución,...