Escogiendo un vector de clonación en español
Páginas: 14 (3292 palabras)
Publicado: 1 de agosto de 2014
La elección de un Vector de clonación
Andrew Preston
1. Introducción
Desde la construcción de la primera generación de vectores de clonación
generales en la década de 1970, el número de plásmidos creados ha aumentado a
casi innumerables. Por lo tanto, una decisión crítica que enfrenta el investigador
de hoy es el de que el plásmido de usar en un proyecto en particular? A pesar de
laelección desconcertante de vectores disponibles comerciales y otros, la elección
de qué vector de clonación para usar puede ser decidido por la aplicación de un
pequeño número de criterios: insertar tamaño, número de copias, incompatibilidad,
marcador
seleccionable,
sitios
de
clonación,
y
funciones
vectoriales
especializadas. Varios de estos criterios son dependientes entre sí.Este capítulo
trata de estos criterios en el contexto de la elección de un plásmido para su uso
como un vector de clonación y en la Tabla 1 muestra las características de
algunos vectores de clonación de uso común.
2. Criterios para la elección de un Vector de clonación
2.1. Inserte Tamaño
Para proyectos en los que se desea que un trozo particular de ADN se clonó, Una
consideración es eltamaño de la inserción de ADN. La mayoría de los plásmidos
de clonación generales pueden llevar a un ADN insertar hasta alrededor de 15 kb
de tamaño. Insertos en exceso de este lugar las restricciones sobre la correcta
replicación de los plásmidos (particularmente para los vectores de alta el número
de copias) y pueden causar problemas con la estabilidad de inserción. Varios tipos
de vectoresestán disponibles para la clonación de fragmentos grandes de ADN.
Estos son los más utilizados para la construcción de bibliotecas de clones que a
menudo son representativos de todo el genoma. Clones de la biblioteca se criban
para identificar el clon particular que lleva el ADN de interés.
2.1.1. Los cósmidos (1,2)
Los cósmidos son vectores convencionales que contienen una pequeña regiónde
ADN
bacteriófago que contiene el sitio de extremo cohesivo (COS). Este
contiene todos los elementos que actúan en cis
en partículas
para el envasado de ADN viral
. Para la clonación de ADN en estos vectores, fragmentos de ADN
genómico lineales se ligan in vitro con el ADN vector y esto es
luego
empaquetados en partículas de bacteriófago (véase el capítulo 7). Enintroducción
en Escherichi coli células huésped, el vector es circularized para formar un gran
plásmido que contiene el fragmento de ADN clonado. Los cósmidos son los más
utilizados para generar las grandes bibliotecas de inserción. Debido a las
limitaciones de envasado, el vector más inserto deberían comprender entre 28 y
45 kb.
El genoma del bacteriófago λ comprende 48.502 pb. Al entrar en lacélula
huésped, el fago adopta una de dos ciclos de vida: crecimiento lítico o lisogenia.
En el crecimiento lítico, aproximadamente 100 nuevos viriones se sintetizan y
envasados antes de la lisis de la célula huésped, la liberación de la progenie del
fago para infectar nuevos huéspedes. En la lisogenia, el genoma del fago se
somete a la recombinación en el cromosoma huésped, donde se replica yse
hereda junto con el ADN del anfitrión (3). Cuál de los dos ciclos de vida diferentes
se adoptó se determina por la multiplicidad de la infección y el estado nutricional
de
la
célula
huésped.
Cuanto
mayor
sea
la
multiplicidad
de
infección y el más pobre es el estado nutricional de la célula, más lysogeny se ve
favorecida (4).
El uso de λ como un vector declonación implica sólo el ciclo lítico. Esto hace que
el tercio medio de la genoma λ, que codifica funciones para la regulación de la
expresión génica y el establecimiento de la lisogenia, redundante para estos fines.
Es la capacidad de reemplazar esta porción del genoma con ADN extraño sin
afectar el ciclo de vida lítico que hace que λ útil como vector de clonación.
λ
Vectores
de...
Andrew Preston
1. Introducción
Desde la construcción de la primera generación de vectores de clonación
generales en la década de 1970, el número de plásmidos creados ha aumentado a
casi innumerables. Por lo tanto, una decisión crítica que enfrenta el investigador
de hoy es el de que el plásmido de usar en un proyecto en particular? A pesar de
laelección desconcertante de vectores disponibles comerciales y otros, la elección
de qué vector de clonación para usar puede ser decidido por la aplicación de un
pequeño número de criterios: insertar tamaño, número de copias, incompatibilidad,
marcador
seleccionable,
sitios
de
clonación,
y
funciones
vectoriales
especializadas. Varios de estos criterios son dependientes entre sí.Este capítulo
trata de estos criterios en el contexto de la elección de un plásmido para su uso
como un vector de clonación y en la Tabla 1 muestra las características de
algunos vectores de clonación de uso común.
2. Criterios para la elección de un Vector de clonación
2.1. Inserte Tamaño
Para proyectos en los que se desea que un trozo particular de ADN se clonó, Una
consideración es eltamaño de la inserción de ADN. La mayoría de los plásmidos
de clonación generales pueden llevar a un ADN insertar hasta alrededor de 15 kb
de tamaño. Insertos en exceso de este lugar las restricciones sobre la correcta
replicación de los plásmidos (particularmente para los vectores de alta el número
de copias) y pueden causar problemas con la estabilidad de inserción. Varios tipos
de vectoresestán disponibles para la clonación de fragmentos grandes de ADN.
Estos son los más utilizados para la construcción de bibliotecas de clones que a
menudo son representativos de todo el genoma. Clones de la biblioteca se criban
para identificar el clon particular que lleva el ADN de interés.
2.1.1. Los cósmidos (1,2)
Los cósmidos son vectores convencionales que contienen una pequeña regiónde
ADN
bacteriófago que contiene el sitio de extremo cohesivo (COS). Este
contiene todos los elementos que actúan en cis
en partículas
para el envasado de ADN viral
. Para la clonación de ADN en estos vectores, fragmentos de ADN
genómico lineales se ligan in vitro con el ADN vector y esto es
luego
empaquetados en partículas de bacteriófago (véase el capítulo 7). Enintroducción
en Escherichi coli células huésped, el vector es circularized para formar un gran
plásmido que contiene el fragmento de ADN clonado. Los cósmidos son los más
utilizados para generar las grandes bibliotecas de inserción. Debido a las
limitaciones de envasado, el vector más inserto deberían comprender entre 28 y
45 kb.
El genoma del bacteriófago λ comprende 48.502 pb. Al entrar en lacélula
huésped, el fago adopta una de dos ciclos de vida: crecimiento lítico o lisogenia.
En el crecimiento lítico, aproximadamente 100 nuevos viriones se sintetizan y
envasados antes de la lisis de la célula huésped, la liberación de la progenie del
fago para infectar nuevos huéspedes. En la lisogenia, el genoma del fago se
somete a la recombinación en el cromosoma huésped, donde se replica yse
hereda junto con el ADN del anfitrión (3). Cuál de los dos ciclos de vida diferentes
se adoptó se determina por la multiplicidad de la infección y el estado nutricional
de
la
célula
huésped.
Cuanto
mayor
sea
la
multiplicidad
de
infección y el más pobre es el estado nutricional de la célula, más lysogeny se ve
favorecida (4).
El uso de λ como un vector declonación implica sólo el ciclo lítico. Esto hace que
el tercio medio de la genoma λ, que codifica funciones para la regulación de la
expresión génica y el establecimiento de la lisogenia, redundante para estos fines.
Es la capacidad de reemplazar esta porción del genoma con ADN extraño sin
afectar el ciclo de vida lítico que hace que λ útil como vector de clonación.
λ
Vectores
de...
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