Espectocolorimetria

Métodos para la cuantificación de proteínas
Emilio Fernández Reyes y Aurora Galván Cejudo
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa,14071-Córdoba
En esta práctica se utilizaran tres métodos para la cuantificación de proteínas: Biuret, Bradford y BCA. Para cada uno de los métodos se realizaran: una curva estándar, el cálculo delcoeficiente de extinción y el rango de sensibilidad. Se realizará la cuantificación de dos muestras problemas de baja y alta concentración, respectivamente, y se discutirá las ventajas e inconvenientesde cada uno de los métodos.
Palabras clave:
Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de unaproteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.
Existen diferentes métodospara la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) lacapacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. En la Tabla I se recogen los métodos más usados así como sus respectivas sensibilidades. Cada uno de estos métodos tiene sus ventajas einconvenientes, las principales se recogen en la Tabla II.
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Tabla I. Principales métodos para la cuantificación de proteínas y sus rangos de
sensibilidad
Método Rango de sensibilidad
(μg)Coeficiente de extinción o Cálculo de la
concentración
Métodos de
Absorción
A280
A205
A280 - A260
A235 - A280
A224 - A236
A215 - A225
100-3000
3-100
100-3000
25-700
5-180
2-45
ε280 = 1 mL/mg cmε205 = 31 mL/mg cm
Proteína (mg/mL) = (1.55A280 – 0.76A260)
Proteína (mg/mL) = (A235 – A280)/2.51
Proteína (mg/mL) = (A224 – A236)/0.6
Proteína (μg/mL) = 144(A215 – A225)
Métodos Derivados...