Espectofotometría: Cuatificación De Proteínas Totales Por El Metodo De Biuret

ESPECTOFOTOMETRÍA: CUATIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES POR EL METODO DE BIURET






OBJETIVOS

• Fijar conocimiento teóricos previamente estudiados mediante el trabajo en el laboratorio

• Familiarizarnos con los elementos y sustancias necesarias para llevar a cabo el método de Biuret.


• Observar y relacionar las diferentes reacciones con las concentraciones de las solucionesocupadas.

• Aplicar y entender las formulas adecuadas que se estudiaron previamente.
























INTRODUCCIÓN

Todo método espectrofotométrico se basa en la comparación de la absorbancia de una sustancia de concentración desconocida con la de una solución de la misma sustancia cuya concentración se conoce y a la cual se denomina solución patrón o estándar.La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todos loscomponentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0.
La absorción de luz por parte de una sustancia es una propiedad característica de ella, que puede ser utilizada para su identificación y cuantificación.
Todas lassustancias absorben luz en alguna región del espectro electromagnético (VIS, UV, IR, etc.).
La absorción de luz depende de la estructura química del compuesto absorbente, y en especial de ciertos grupos funcionales, de modo que es posible identificar un compuesto por medio de las características de su espectro de absorción.
Lambert y Beer demostraron que la absorbancia (A), también llamadadensidad óptica (D.O.) de una sustancia es directamente proporcional a la concentración (C) de la sustancia absorbente, la longitud del paso de luz (espesor de la solución) y una constante denominada coeficiente de extinción o coeficiente de absorción, que es característico para cada sustancia a una longitud de onda determinada.
Para medir la absorbancia de una sustancia se utiliza elespectrofotómetro, instrumento destinado a medir la absorción por especies inorgánicas y orgánicas de luz monocromática en la región ultravioleta / visible del espectro.
El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida. Basándose en la formación de un complejo coloreado entreel Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH.
El Reactivo de Biuret está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6•4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. La intensidad de lacoloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.
Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un método colorimétrico que permite determinar la concentración deproteínas de una muestra mediante espectroscopía ultravioleta-visible a una longitud de onda de 540 nm. (para detectar el ión Cu2+).















Materiales y Métodos
Se rotularon 10 tubos de ensayo con los números del 1 al 10 con la cantidad de albúmina (patrón) que a cada uno se le añadió, en el caso de los primeros 8 (de 0 a 0,7ml.), en los dos tubos restantes sólo se...